负载咖啡酸的水凝胶减轻炎症并加速感染伤口愈合

《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：A caffeic acid-loaded hydrogel attenuates inflammation and accelerates infected wound healing

　　

摘要
引言：感染伤口常伴有持续性细菌定植、失调的炎症反应和加剧的氧化应激，这些因素恶化了局部微环境并阻碍组织修复。因此，开发具有抗菌、抗氧化和炎症调节特性的生物活性敷料具有重要意义。本研究旨在构建一种负载咖啡酸的双网络水凝胶（caffeic acid-loaded double-network hydrogel, H(CODEXC)），并评估其治疗感染伤口的潜力。方法：研究人员对水凝胶的多孔结构、液体吸收能力和释放行为进行了表征。进一步在体外评估了其细胞相容性、血液相容性、抗菌活性、抗氧化能力以及对巨噬细胞和成纤维细胞的调节作用。此外，建立了感染的全层皮肤缺损模型，以评估其体内治疗功效。结果：该水凝胶展现出良好的多孔结构和液体吸收能力，并实现了咖啡酸的持续释放。它还表现出良好的细胞相容性和血液相容性，对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大肠杆菌（Escherichia coli）具有强抑制作用，并增强了自由基清除活性。此外，该水凝胶上调了巨噬细胞中Arg-1的表达，下调了iNOS的表达，促进巨噬细胞向抗炎的M2表型极化，同时增强了成纤维细胞中Col I和Col III的表达。在体内，该水凝胶改善了局部感染状态，加速了伤口愈合，增强了再上皮化和胶原沉积。结论：这些发现表明，负载咖啡酸的双网络水凝胶不仅减少了感染伤口中的细菌负荷和氧化应激，还通过调节炎症相关细胞表型和促进细胞外基质合成来改善局部修复微环境，从而加速组织再生。本研究为感染伤口的生物活性敷料设计提供了新策略，并为整合感染控制与组织修复的局部治疗方法提供了实验证据。

**论文解读：负载咖啡酸的双网络水凝胶通过减轻炎症和氧化应激加速感染伤口愈合**

**研究背景与问题**

感染伤口的修复是临床医学的重大挑战。伤口愈合是一个涉及止血、炎症、增殖和重塑等多个重叠阶段的高度协调生物学过程。然而，细菌感染、过度的炎症反应和氧化应激会扰乱这一精密调控的级联反应，导致愈合延迟甚至修复失败。手术部位感染（surgical site infection, SSI）是医院获得性感染（hospital-acquired infection, HAI）中最常见的类型之一，在欧洲医院中，发生SSI患者的经济负担约为未发生SSI患者的两倍。虽然抗生素和基于纳米材料的抗菌剂被广泛应用，但抗生素过度使用导致的耐药性，以及银、锌、铜等纳米颗粒的细胞毒性和环境风险限制了其长期应用。因此，近年来的生物材料策略越来越强调同步控制感染和调节微环境。此外，过度的炎症浸润会中断愈合过程，而免疫调节细胞（包括巨噬细胞和成纤维细胞）的功能障碍会导致持续性炎症和组织再生受损。值得注意的是，过量的活性氧（reactive oxygen species, ROS）被认为是感染伤口延迟愈合的主要机制之一。生理水平的ROS通过抗菌活性和信号调节有助于早期伤口修复，但持续的ROS过度产生会诱导氧化应激，造成脂质、蛋白质和DNA的氧化损伤，促进局部细胞凋亡，并损害成纤维细胞、角质形成细胞和内皮细胞的正常功能，从而加剧炎症、阻碍血管生成和细胞外基质重塑，使伤口长期处于炎症状态，最终导致组织修复受损和慢性化。

咖啡酸（caffeic acid, CA）是一种天然植物酚类化合物，具有抗菌、抗炎、抗氧化等多种生物活性，但其水溶性差、稳定性低和生物利用度受限，限制了其生物医学应用。因此，开发合适的载体系统以改善其局部递送和生物学功效对于扩大其在伤口修复中的应用具有重要意义。理想的伤口敷料应具备优异的生物相容性、保湿性、透气性、抗菌活性和抗氧化能力，同时能吸收伤口渗出液并促进愈合。水凝胶因其高含水量和三维网络结构，能为伤口提供湿润环境并促进气体交换，但传统水凝胶功能有限。双网络水凝胶通过动态共价键和物理交联的协同整合，展现出优异的机械性能、自愈合能力以及持续可控的药物释放能力。基于此，研究人员假设构建一种基于羧甲基壳聚糖（carboxymethyl chitosan, CMCS）衍生物和氧化葡聚糖（oxidized dextran, ODex）的双网络水凝胶，并负载咖啡酸，能改善感染伤口的失调微环境并促进组织修复。

**研究目的与意义**

该研究旨在构建一种负载咖啡酸的双网络水凝胶（H(CODEXC)），并综合评估其理化性质、生物相容性、抗菌、抗氧化、免疫调节及促修复能力，进而验证其在感染全层皮肤缺损小鼠模型中的治疗效果。此项研究的意义在于：第一，该水凝胶系统整合了双网络水凝胶的结构支撑与咖啡酸的生物活性，实现了多靶点协同干预感染伤口的局部微环境；第二，为感染伤口的生物活性敷料设计提供了新策略，并为将感染控制与组织修复相结合的局部治疗方法提供了实验证据。该论文发表在《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》。

**主要关键技术方法**

为开展研究，研究人员采用了以下主要关键技术方法：1）通过自由基聚合和席夫碱反应制备了甲基丙烯酰化羧甲基壳聚糖（CMCSMA）与氧化葡聚糖（ODex）组成的双网络水凝胶，并负载咖啡酸得到H(CODEXC)；2）通过核磁共振氢谱（¹H NMR）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）对材料化学结构进行表征；3）利用扫描电子显微镜（SEM）观察水凝胶微观形貌；4）通过CCK-8实验、活/死细胞染色和溶血实验评估细胞相容性和血液相容性；5）采用DPPH自由基清除实验评价抗氧化活性；6）通过平板菌落计数法评估对金黄色葡萄球菌（S. aureus）和大肠杆菌（E. coli）的抗菌活性；7）通过免疫荧光染色和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测巨噬细胞中Arg-1、iNOS等标志物表达以评估免疫调节作用；8）采用细胞划痕实验评估成纤维细胞迁移能力；9）建立小鼠感染全层皮肤缺损模型（使用6周龄BALB/c小鼠），通过大体观察、H&E染色和Masson染色评估体内伤口愈合效果。动物实验获得北京大学人民医院动物伦理委员会批准（2024PHE022）。

**研究结果**

**3.1 H(CODEX)和H(CODEXC)水凝胶的制备与表征**

通过¹H NMR和FTIR成功验证了ODex和CMCSMA的修饰以及双网络水凝胶的形成。SEM显示两种水凝胶均具有蜂窝状多孔微结构，H(CODEXC)因咖啡酸负载呈现出更致密的网络和更小的孔径。溶胀实验表明H(CODEXC)的溶胀比为1309% ± 126.1%，仍保持良好的液体吸收能力。降解实验显示H(CODEXC)降解更快。体外释放实验表明咖啡酸从H(CODEXC)中呈现初期突释（1小时累积释放约30%）随后缓慢释放的模式，72小时累积释放低于60%。

**3.2 H(CODEXC)水凝胶的体外生物相容性**

CCK-8实验和活/死染色显示，H(CODEXC)处理后L929小鼠成纤维细胞活力显著高于空白对照组，且细胞形态良好，无明显细胞毒性。溶血实验显示H(CODEXC)的溶血率低于5%，表明其具有良好的血液相容性。

**3.3 H(CODEXC)水凝胶的体外抗菌活性**

与对照组相比，所有水凝胶处理组均降低了金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的存活率，其中H(CODEXC)表现出最强的抑制作用，表明咖啡酸负载增强了水凝胶的广谱抗菌性能。

**3.4 H(CODEXC)水凝胶的促修复活性**

细胞划痕实验表明，H(CODEXC)组在24小时后的迁移面积率显著高于对照组和H(CODEX)组，提示咖啡酸负载增强了水凝胶促进L929细胞迁移的能力。qRT-PCR结果显示，H(CODEXC)显著上调了成纤维细胞中Col I和Col III的表达，表明其有利于细胞外基质重塑。

**3.5 H(CODEXC)水凝胶的抗氧化活性**

DPPH自由基清除实验显示，H(CODEXC)的DPPH清除率约为80%，显著高于H(CODEX)的约30%，表明咖啡酸负载赋予水凝胶优异的抗氧化能力。免疫荧光和qRT-PCR结果显示，H(CODEXC)上调了巨噬细胞中Arg-1和IL-10的表达，下调了iNOS和TNF-α的表达，促进巨噬细胞向抗炎/促修复表型极化。

**3.6 H(CODEXC)水凝胶的体内伤口愈合效果评价**

在小鼠感染全层皮肤缺损模型中，H(CODEXC)组的大体观察显示伤口床更干净，收缩更明显。定量分析表明，第12天时H(CODEXC)组残余伤口面积（4.1%）显著小于对照组（17.7%）。H&E染色显示H(CODEXC)组再上皮化更完整、炎性细胞浸润显著减少；Masson染色显示H(CODEXC)组胶原沉积更丰富、排列更连续致密。这些结果表明H(CODEXC)能有效促进感染伤口的愈合、再上皮化和组织重塑。

**讨论总结与结论**

讨论部分指出，感染伤口的修复受多种不利因素阻碍，单一敷料覆盖或单药作用难以实现有效治疗。研究人员基于此构建了双网络水凝胶平台，并选择咖啡酸作为功能分子，因其生物活性与感染伤口修复的核心治疗需求高度匹配。H(CODEXC)通过抗菌、抗氧化和炎症调节作用协同改善感染伤口微环境。研究还强调，咖啡酸的释放模式（初期突释后缓慢释放）有利于早期快速发挥作用并维持长期效果。在调节炎症方面，H(CODEXC)促进巨噬细胞M2极化，上调抗炎因子，抑制促炎因子，并结合其抗氧化作用，同步调控炎症和氧化应激，同时抑制细菌生长，从而为组织再生创造有利环境。此外，H(CODEXC)促进成纤维细胞迁移和胶原基因表达，在体内也得到了组织学验证。从转化角度看，H(CODEXC)具有良好的液体吸收能力和生物相容性，同时具备主动干预微环境的能力，有望发展为新型功能敷料。但研究也存在局限性：主要基于体外实验和小鼠模型，不能完全模拟临床复杂性；体内实验样本量较小；长期毒性和降解产物安全性缺少系统研究；咖啡酸在体内的释放行为和精确分子机制尚未完全阐明。

**研究结论**

在本研究中，成功构建了负载咖啡酸的双网络水凝胶H(CODEXC)。该水凝胶表现出良好的理化性质、生物相容性和持续的药物释放行为，以及相对于无药水凝胶更优异的抗菌和抗氧化活性。体外抗菌实验表明，H(CODEXC)能更有效地抑制金黄色葡萄球菌（S. aureus）和大肠杆菌（E. coli），表明咖啡酸负载增强了水凝胶的广谱抗菌性能。进一步分析表明，H(CODEXC)调节了巨噬细胞表型并促进了成纤维细胞相关的基质重塑。体内实验进一步证实了该水凝胶改善了感染伤口的局部微环境，促进了伤口闭合、再上皮化和胶原沉积。H(CODEXC)代表了一种用于感染伤口的生物活性敷料设计的有效策略，并在局部抗感染治疗、减轻氧化应激和促进组织修复方面具有相当大的潜力。