综述：建立科学信心：重建人呼吸道上皮（RHRE）用于评估呼吸效应的人类生物学相关性

《Frontiers in Toxicology》：Establishing scientific confidence: human biological relevance of reconstructed human respiratory epithelium (RHRE) for assessing respiratory effects

　　

体外试验方法可用于评估吸入物质对人呼吸道的影响。由于对最大化可靠性和人类相关性的兴趣，以及因此保护人类健康的能力，研究人员越来越多地使用这些工具。在这些体外模型中，重建人呼吸道上皮（reconstructed human respiratory epithelium, RHRE）旨在模拟人呼吸道生物学的各个方面，并反映由不同损伤（包括化学暴露）扰动的机制。本文评估了RHRE（特别是MucilAir模型）的人类生物学相关性，以衡量使用基于RHRE的试验方法评估呼吸效应的信心。虽然本文聚焦于MucilAir，但许多关键概念也适用于其他RHRE模型。MucilAir的关键特征，如存在产生黏液（mucus）和具有摆动纤毛（beating cilia）的相关原代人细胞，证明了其与人类生物学的相关性。该模型适用于一系列测定方法（例如评估细胞毒性（cytotoxicity）、细胞活力（cell viability）和细胞屏障完整性（cellular barrier integrity）），这些方法测量暴露后可能在人类中发生的关键事件。在本文中，研究人员还展示了这些模型如何被用于预测吸入物质毒性的案例研究。总体而言，RHRE可用于提供对化学物质对人呼吸道潜在效应的定量、基于机制的理解。

2 重建人呼吸道上皮MucilAir的人类生物学相关性
MucilAir由原代人细胞构建，代表目标物种（人类）。其细胞类型包括基底细胞、纤毛细胞和产黏液的杯状细胞，且比例与人体相似。可添加成纤维细胞（MucilAir-HF版本）以研究基质-上皮相互作用或纤维化。模型覆盖鼻、气管和支气管区域，允许选择最可能受测试物质靶向或最敏感的区域。单供体版本提供供体特异性和非特异性反应的机制信息，并支持按人口统计学特征（如性别、年龄）或遗传背景进行分层研究；混合供体版本则平均化供体变异，适合高通量或重复实验。MucilAir在空气-液体界面（air-liquid interface, ALI）培养，模拟人呼吸道一侧暴露于空气、另一侧接收营养的生理状态。分化后稳定数月至一年，支持慢性暴露和重复给药评估。使用化学成分明确、含有人源生长因子和激素的培养基，消除了动物来源成分的批次变异性。
组织学上，MucilAir呈现假复层结构，与人体鼻、气管和支气管上皮相似，可复制临床组织学发现，如杯状细胞增生和鳞状化生。其黏液层厚度（10 μm）和上皮细胞层厚度（30–40 μm）接近人体。MucilAir产生的气道表面液体（airway surface liquid, ASL）和纯化黏液与人痰液相比，具有相似的黏蛋白含量，但黏度更低，归因于组成差异。蛋白质组学分析显示，MucilAir ASL与人痰液共享近50%的蛋白质，但浓度不同，因为痰液来源于多种细胞（包括免疫细胞），而MucilAir仅来自呼吸上皮。MucilAir具有摆动纤毛，覆盖至少60%的表面面积，纤毛摆动频率略高于人体气管支气管外植体，但清除速率可能因温度和培养基而异。模型具备代谢能力，在特定条件下能激活代谢酶，如暴露于二噁英、烟草产品或香豆素时，可诱导细胞色素P450（cytochrome P450, CYP）酶活性；但萘的生物转化研究显示II相代谢存在局限性，可能与位点特异性代谢、供体敏感性或培养时长有关。MucilAir形成紧密屏障，跨上皮电阻（transepithelial electrical resistance, TEER）值高于200 Ω·cm2，具有主动离子转运功能，保留囊性纤维化跨膜传导调节因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR）、上皮钠通道（epithelial sodium channel, ENaC）和钠钾ATP酶（Na/K ATPase）的活性，并表达活性ATP结合盒（ATP-binding cassette, ABC）转运蛋白，如P-糖蛋白（P-glycoprotein, P-gp）和乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein, BCRP）。模型可释放相关细胞因子、趋化因子和金属蛋白酶，响应刺激。因此，MucilAir可用于评估屏障完整性、细胞毒性、代谢活性、纤毛功能、氧化应激和促炎标志物释放等毒性关键指标，并适用于组织学分析。

3 应用MucilAir评估物质介导的呼吸效应
3.1 一般考虑
3.1.1 化学领域
MucilAir已广泛应用于多种物质类型，包括农用化学品、细颗粒和超细颗粒、汽油排放物、烟草制品、药品和工业化学品。可测试固体（颗粒、纤维）、液体气溶胶、气体和蒸气等多种物理形态的物质，粒径范围从纳米到微米，比啮齿类动物气道更接近人类暴露。模型选择需考虑目标呼吸区域，如鼻或气管支气管区域不适合预期毒性仅发生在下呼吸道的物质。
3.1.2 暴露模式
物质可通过液体移液或使用体外ALI暴露装置进行递送。液体应用操作简便、剂量控制明确且易转移；气溶胶系统更符合生理学但需专业知识。物质理化性质指导模式选择：易水解物质适合非加湿气溶胶或蒸气暴露，难雾化物质适合液体应用。
3.1.3 暴露时长
MucilAir支持单次或重复给药方案，暴露时间从数小时到数天，因其长期稳定性可评估急性和慢性效应，并在暴露后设置恢复窗口以研究毒性可逆性。
3.1.4 效应范围
可通过剂量依赖性反应区分物质毒性强弱，暴露后组织可直接处理或维持培养以观察恢复。当前数据支持RHRE模型用于识别引起接触点毒性的物质，但需谨慎设计实验方案（如气流、液体体积、清洗次数和暴露时长）以确保生理相关性。
3.2 基于RHRE的方法在监管中的应用
3.2.1 案例研究1：RHRE用于杀菌剂再注册
为响应美国环保局（EPA）对百菌清（chlorothalonil）吸入毒性的重新评估，提出基于非动物证据权重的方案。计算流体动力学（computational fluid dynamics, CFD）模型显示颗粒主要沉积于上导气道，支持使用MucilAir。通过液体移液暴露单供体和混合供体组织，评估细胞毒性、屏障功能和代谢活性，使用基准剂量（benchmark dose, BMD）模型推导吸入毒性的起始点。结果被EPA采纳，并作为经济合作与发展组织（OECD）综合测试与评估方法（IATA）案例研究发表。
3.2.2 案例研究2：RHRE评估化妆品成分的潜在吸入毒性
乙酰化香根油（AVO）作为化妆品香料成分，需评估喷雾产品吸入风险。由于低挥发性，系统性暴露通过2-Box模型计算，吸入途径贡献远小于皮肤途径。局部呼吸毒性采用吸入毒理学关注阈值（TTC_inh）和MucilAir体外局部呼吸道刺激试验。液体应用10 μL代表最坏急性暴露场景，评估TEER、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）、细胞因子和组织病理学。最高浓度5%（w/w）引起轻微毒性且7天后逆转，最低有害作用水平（NOAEL）为1%（w/w），但远高于实际暴露水平。欧盟消费者安全科学委员会（SCCS）审查后批准AVO在喷雾化妆品中安全使用。

4 讨论
人类相关体外方法可规避物种不确定性，提供定性和定量信息及机制洞察。MucilAir在结构、功能和组织学上与人体呼吸道上皮高度相似，能复制关键要素如紧密屏障、黏液产生、摆动纤毛和代谢活性。然而，模型缺乏免疫、血管和平滑肌细胞，不适用于免疫介导反应（如呼吸致敏或支气管收缩）。此外，其代谢能力尚需进一步表征，且仅代表单个呼吸区域，无法评估全身毒性。尽管如此，MucilAir已用于支持监管决策。案例研究展示了综合多数据流（理化性质、暴露场景、靶区域）进行风险评估的价值。当前重点在于标准化测试方案以促进数据比较和方法稳健性评估，包括多实验室验证、终点测量标准化（如TEER和纤毛摆动频率）以及报告标准制定。总体而言，RHRE基于生物相关性和技术成熟度，为评估吸入效应提供了有力工具。