《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Proteomic and transcriptomic signatures of cytoskeletal remodeling during morphogenesis in the basal metazoan Halisarca dujardinii (Porifera)
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摘要：海绵能够从解离的体细胞重建完整的功能性生物体。这一壮举需要根本性的细胞骨架重编程，但其分子逻辑仍然未知。利用北极寻常海绵Halisarca dujardinii，研究人员绘制了自由游动的幼虫、固着成体和早期细胞聚集体中的分子特征。通过整合RNA-seq、
摘要：海绵能够从解离的体细胞重建完整的功能性生物体。这一壮举需要根本性的细胞骨架重编程，但其分子逻辑仍然未知。利用北极寻常海绵Halisarca dujardinii，研究人员绘制了自由游动的幼虫、固着成体和早期细胞聚集体中的分子特征。通过整合RNA-seq、单细胞解卷积、DIA-LC-MS蛋白质组学、天然复合物分级、活细胞蛋白酶体成像和免疫荧光技术，研究人员鉴定了与阶段相关的细胞骨架蛋白及翻译后修饰（PTMs）谱。幼虫富集非经典肌球蛋白（Myosin-9/15）和动态微管以支持运动；成体利用血影蛋白支架和去乙酰化微管以维持稳定性；细胞聚集体则转向依赖微管运输，伴随靶向蛋白水解和分化的肌动蛋白HdA6及铁蛋白上的阶段特异性PTMs。活细胞成像显示，在形成中的聚集体内细胞接触处存在泛素非依赖的20S蛋白酶体活性，而质谱分析揭示了与细胞骨架重塑重合的协同甲硫氨酸氧化和泛素化事件。尽管批量数据无法完全区分细胞类型组成与细胞内重编程，但多层特征表明存在一个严格调控的阶段特异性程序。总之，这些发现建立了一个关联框架，将细胞骨架结构、氧化还原敏感型PTMs和蛋白稳态联系起来，用于理解海绵发育和早期再聚集阶段。研究人员提出，保守的结构网络通过化学调谐得以实现形态可塑性，这对于早期分支后生动物的多细胞形态发生具有基础意义，并为未来的功能研究奠定了基础。
**论文解读文章**
**研究背景与问题**
多细胞动物的形态发生依赖于细胞骨架的动态重编程，然而不同动物类群的机制差异显著。在扁形动物、水螅和蝾螈等模式生物中，细胞骨架的调控模式已有所描述，但作为最早期分支的后生动物之一，海绵（Porifera）拥有从解离细胞重建完整功能个体的惊人能力，这一现象自Wilson（1907）的实验以来备受关注。然而，驱动这种形态可塑性的分子机制仍不清楚，尤其是翻译后修饰（PTMs）如何在不依赖从头合成的情况下重塑现有蛋白支架，以及生命阶段之间的综合蛋白质组比较尚属空白。本研究以北极寻常海绵Halisarca dujardinii为模型，其缺乏矿化骨针且具有卓越的再聚集能力，旨在探究自由游动幼虫、固着成体和细胞聚集体之间细胞骨架重塑的分子逻辑。通过整合多组学方法，研究人员建立了转录程序、蛋白质丰度与PTM动态之间的关联框架，揭示了保守结构网络的化学调谐可能是早期后生动物实现形态可塑性的古老策略。该论文发表在《Frontiers in Cell and Developmental Biology》。
**主要技术方法**
本研究采用多种关键技术方法：RNA-seq转录组分析（三个生物学重复：成体、幼虫、24小时细胞聚集体）、DIA-LC-MS蛋白质组学（Ultimate 3000 Nano LC系统偶联Orbitrap Tribrid Lumos质谱仪，基于H. dujardinii基因组数据库鉴定和定量）、单细胞RNA-seq数据解卷积（利用先前发表的scRNA-seq数据，NCBI BioSample SAMN42483027和SAMN42483028）、活细胞共聚焦显微镜（Zeiss LSM880，使用Me4BodipyFL-Ahx3Leu3VS探针检测蛋白酶体活性）、天然PAGE电泳及质谱分析翻译后修饰（包括氧化、脱酰胺、氨甲酰甲基化、泛素化等）。样本来源于白海亚北极地区（66°30′N, 33°08′E）的H. dujardinii，包括自然同步采集的成体、自由游动幼虫以及体外解离细胞形成的24小时聚集体。
**研究结果**
**1. Proteomic analysis of larval and adult H. dujardinii**
通过DIA-LC-MS鉴定出10,733个蛋白质。主成分分析显示幼虫与成体样本分离。成体中丰度最高的蛋白质包括保守肌动蛋白HdA1/2/3和铁蛋白HdF1a/b、20S蛋白酶体α4亚基（PSMA4）等。差异表达分析（|log2FC| > 1, FDR < 0.05）发现1,213个蛋白质差异显著，其中272个仅存在于成体，86个仅存在于幼虫。GO富集分析显示成体上调蛋白富集于肌动蛋白骨架动态调控和微管去乙酰化过程，下调蛋白富集于微管组织化和微管运输。
**2. Microtubule organization across stages**
免疫荧光染色（抗α-微管蛋白抗体DM1A）显示：成体中微管信号几乎仅集中于领细胞的鞭毛轴丝，细胞内微管稀疏；幼虫中几乎所有细胞均具有发达的胞质微管网络，且存在无鞭毛和有鞭毛两种形态；24小时细胞聚集体中未发现领细胞鞭毛，但许多细胞存在胞质微管。这表明微管组织在阶段间存在显著重构。
**3. Transcriptomic profiling across life stages**
RNA-seq鉴定出15,132个表达基因，比较分析发现幼虫中有7,509个差异表达基因（DEGs），而24小时细胞聚集体中仅106个DEGs（与成体相比）。关键细胞骨架基因表达分析显示：幼虫中非经典肌球蛋白（Myosin-15、Myosin-9）表达最高，成体中profilin、filamin和spectrin表达最高，而细胞聚集体中肌动依赖运动调控因子表达最低，α-微管蛋白mRNA水平约为成体的一半。
**4. Deconvolution of cellular composition**
单细胞RNA-seq解卷积分析显示，研究阶段涉及细胞组成的重组。成体中以cluster 0_2（领细胞和原细胞）和cluster 7（神经样扁细胞）为主；细胞聚集体中主要簇为cluster 15（富含神经钙蛋白同源物和受体酪氨酸激酶）和cluster 5（过渡性领细胞到扁细胞）；幼虫中主要为cluster 8（过渡性扁细胞）。特定簇的细胞骨架相关基因表达变化可能影响功能重组，如Myosin-15在幼虫扁细胞簇中高表达，Rho GDP解离抑制因子（ARHGDI）在细胞聚集体簇15中上调。
**5. Post-translational modifications and proteasome activity**
尽管转录调控广泛，但核心成分（如肌动蛋白HdA1/2/3和20S蛋白酶体）丰度在阶段间保持稳定，提示PTM可能发挥关键作用。活细胞共聚焦显示，再聚集细胞中伪足含有活性蛋白酶体，细胞-细胞接触处出现脉冲式荧光信号，且1.5小时后聚集体内细胞荧光强度显著高于单个细胞。天然PAGE分析显示，细胞聚集体中糜蛋白酶样蛋白酶体活性（ChLA）主要与20S核心颗粒相关。蛋白酶体抑制剂硼替佐米剂量依赖性地损害聚集体发育（面积增大，圆形度降低），且聚集体无法进展到后期阶段。质谱分析揭示阶段特异性PTMs：α-微管蛋白在成体中主要磷酸化S379，幼虫和聚集体中特异性磷酸化Y312；β-微管蛋白呈现顺序性氧化谱变化；分化的肌动蛋白HdA6在聚集体中发生M48氧化和氨甲酰甲基化，在幼虫中呈现最大PTM多样性（氧化、氨甲酰甲基化、脱酰胺、甲基化、泛素化）。此外，细胞聚集体特异性检测到氧化型ARPC2和泛素化铁蛋白HdF1a/b，且硼替佐米处理改变了泛素化位点分布。
**讨论与结论**
研究人员在讨论部分指出，本工作首次表征了同一北极生境中自然同步采集的成体和幼虫海绵的蛋白质组，揭示了支持发育转变和细胞再聚集的广泛细胞骨架重塑。幼虫通过非经典肌球蛋白和动态微管实现运动，成体通过profilin、filamin和spectrin支架维持结构稳定性，细胞聚集体则下调肌动基运动调控因子转向微管依赖运输与靶向蛋白水解。单细胞解卷积将特定肌球蛋白定位于扁细胞样簇，证实阶段特异性调控而非单纯细胞比例变化。尽管批量化组学无法完全区分细胞内重编程与细胞类型丰度变化，但多层面证据表明保守结构网络通过氧化还原敏感型PTM、靶向蛋白水解和选择性表达调控蛋白实现“化学调谐”。结论部分翻译如下：在H. dujardinii中，形态可塑性源于扁细胞样细胞的阶段特异性表达与保守结构支架的动态翻译后调谐之间的相互作用。这种“化学重布线”协调氧化还原敏感型PTMs、靶向蛋白水解和调控性细胞骨架蛋白的选择性表达，可能代表了细胞重组的古老策略。尽管仍需直接功能验证，但该框架强调了后生动物树基部操作的复杂调控网络，并提示现有蛋白网络的翻译后控制在多细胞形态发生的早期演化中可能发挥了基本作用。
