PathwayDenester：一种通过考虑重叠结构改进通路富集分析的新方法

《BMC Methods》：PathwayDenester: a novel method for improving pathway enrichment analyses by taking overlap structures into account

　　

背景： 通路富集分析（Pathway Enrichment Analysis, PEA）是测量感兴趣基因在任何注释基因列表中过表征的有力方法，常用于以易于解释的术语描述选定的基因列表。当前的通路富集方法独立测试每个通路，未考虑层级术语结构（较大的术语包含若干较小的、部分相交的术语，并依次包含更小的术语）。因此，一些高度显著的通路不可避免地与其他通路共享全部或部分基因，而这些其他通路仅基于相交基因也会被视为富集。“搭车（hitchhiking）”特性影响所有共享基因的通路，夸大其显著性，常使其统计显著性优于其他相关通路，从而误导结果解读。该效应还产生高度重复的结果，许多通路可共享超过90%的基因。 方法： PathwayDenester将其他通路纳入考量，基于通路自身富集而非通过与更显著通路交集基因富集的可能性评估每个通路。通过对每个通路A与相交通路B进行检验实现，考虑通路A的大小、其选中基因数、与通路B的共有基因数及交集中的选中基因数。若落入与通路B交集的选中基因数小于随机期望，则PathwayDenester认为较不显著通路的富集依赖于更显著通路，因而不应作为数据集的良好代表。 结果： 使用真实和模拟数据集进行基准测试时，PathwayDenester过滤掉约40%至90%的推断通路，使富集通路列表在客观上更简洁、更相关，且未损失重要的生物学见解。 结论： PathwayDenester提供了一种系统方法，减少富集通路间的冗余和依赖性，提升通路富集结果的可解释性与生物学相关性。PathwayDenester可免费作为开源Python命令行程序使用，也可通过其网站https://pathwaydenester.pythonanywhere.com/作为网络服务使用。

研究背景与意义

通路富集分析（Pathway Enrichment Analysis, PEA）是转化高通量实验（如RNA-seq、蛋白质组学）产生的长列表分子特征为生物学意义的核心工具，它统计比较实验显著特征与Gene Ontology（GO）、KEGG、Reactome等注释库，判断特定功能基因集是否相对随机过表征。然而，现实中的通路数据库普遍存在层级嵌套与部分基因重叠结构：大通路完全覆盖若干小通路，小通路又彼此相交。传统PEA工具（如DAVID、clusterProfiler、Enrichr）基于超几何检验（或卡方、二项、Fisher精确检验），默认各通路统计独立。当多个嵌套/相交通路共享差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）时，会出现“搭车（hitchhiking）”现象——较宽或相交的通路仅因与更显著通路共享DEGs而表现为统计显著，产生大量冗余显著命中，常共享>90%基因。这膨胀了显著性，误导解读，迫使研究者主观挑选术语，引入结果报告偏倚。现有补救多依赖手动筛选或聚类工具（如REVIGO、MonaGO），但聚类常不优先更显著通路，且新聚类命名困难。另一思路（如gerr）用正则回归替代PEA，但改变检验框架，难与传统结果比对。因此，核心问题是：如何区分通路是独立富集，还是结构性“搭车”？PathwayDenester以此为题，作为PEA的后处理过滤步骤，发表于《BMC Methods》。

主要关键技术方法概括

研究人员开发PathwayDenester，以任何PEA输出的通路p值、选定基因列表及通路-基因成员关系为输入，不依赖特定富集工具或数据库。核心是对每对相交通路进行方向性依赖检验：从最显著通路（More Significant Pathway, MSP）开始，对每一较不显著通路A，计算其DEGs落入与MSP B交集的数目是否显著少于随机期望——改造超几何分布：公式以通路A大小N代总基因数，A中DEGs数m代成功总数，A∩B大小n代抽样数，交集中DEGs数r代抽到成功数，求P(X≥r)得依赖p值；若p<阈值（默认），a被认为依赖b。引入互惠规则（reciprocity>< /><阈）且b不依赖a（p>阈）时，A被过滤。模拟数据：从GO/Reactome/WikiPathways取单通路基因集，构建含0–100%该通路随机基因+0–100%外源随机基因的列表（10%步长），用gProfiler做PEA，再用PathwayDenester默认参过滤。公开数据集验证：选用NASH肝移植炎症对比（448 DEGs）及ZIKV感染JEG-3细胞（174 DEGs）的已发表RNA-seq，复现原PEA后运行PathwayDenester。

研究结果

The impact of the overlap structure of pathways（通路重叠结构的影响）

研究人员以Reactome的“HIV Infection（REAC:R-HSA-162906，225基因）”全部基因为输入做PEA，理论上应仅该通路完美富集，结果却显示960个通路显著，顶层包括更大集如“Infectious disease（REAC:R-HSA-5663205，1000基因，22.5%基因显著）”及更小子集如“Late Phase of HIV life cycle（REAC:R-HSA-162599，132基因，100%覆盖）”。这表明嵌套使大小通路获得相似p值，选大通路（如传染病）易误读为多种疾病信号，选子集易忽略其它生命周期阶段。现实数百显著通路中，作者主观挑选用以讨论或设计后续实验，受预期偏倚影响。

Removing pathways while retaining information（去除通路同时保留信息）

对前40显著通路按重叠聚类，可见16个几乎相同的大块，包括5个完全相同基因集（REAC:R-HSA-167162等）及名异实同的“HIV Transcription Initiation”与“Polymerase II Transcription Initiation”；另有Jaccard≥0.79但名无共词的“NIK→noncanonical NF-kB signaling”“p53-Independent DNA Damage Response”“Vpu mediated degradation of CD4”。PathwayDenester以极低p值（4.51e-10、4.52e-05）排除前两者，表明可在减列表同时保真义，降低人工挑选与偏倚。若MSP平局（完全等同通路），工具给出边缘情况警告。

Reciprocity rule（互惠规则）

（正文此处插入小标题，前文方法已述）：互惠检测防误删共驱动过程。例：若“Neutrophil degranulation”与“lysosome”互相依赖，解释为实验里中性粒细胞溶酶体基因共上调触发脱颗粒，具生物学意义，双边依赖时双留。

Testing PathwayDenester in artificial datasets（人工数据集测试）

模拟：改变列表含REAC:R-HSA-162906基因比例及随机外源基因比例。图4A：随主通路基因比及随机基因增加，显著通路数上升；图4B：PathwayDenester批准数远低于原始富集数，主通路基因占比高时滤波最强；图4C：保留比，极端（主通路基因10%、总富集<100）滤波弱（需求也最低），最优场景滤除~90%。补充图证实不同大小通路趋势一致。

Validation on public datasets（公开数据集验证）

1. 1.
   NASH数据集（Pellegrina D等，肝移植有/无炎症，448 DEGs，286显著通路）：PathwayDenester排除211条（74%）。原作聚类分5类（ECM、Angiogenesis、Leukocyte locomotion、Immune Response、Phosphorylation）。热图显示“Leukocyte locomotion”簇中仅“leukocyte migration”（秩132）免疫特异，却因重叠“locomotion”（秩10）被排除，集群宜归为运动相关。工具还检获“GO:0019199 transmembrane receptor protein kinase activity”与“GO:0030334 regulation of cell migration”互惠富集——解释：细胞迁移调控中跨膜激酶（如FLT4、KDR，血管生成上皮迁移）主导。
2. 2.
   ZIKV感染数据集（Chen Z lu等，JEG-3细胞24h，174 DEGs，158 GO通路）：排除73%显著通路。原突出“defense response to virus”（最显著）、“regulation of viral genome replication”（秩6）、“type I IFN signaling pathway”（秩9）。后者被滤除，因其搭车于更显著超集“negative regulation of viral genome replication”；检查DEGs仅两个III型IFN显著，支持病毒基因组复制被其它机制负调，I型IFN非焦点。

讨论与结论翻译

讨论总结

PEA助研究者从高通量数据识别生物学相关通路，但各通路被独立检验，无视广泛基因重叠，致冗余、常误导的结果——嵌套共享DEGs的多通路同显显著，迫使主观精选。即使作者自知偏倚风险，仍缺客观标准。PathwayDenester用方向性p值区分独立富集与结构搭车，剪除冗余，在保住生物学各异过程下缩减列表~90%，尤其适用于RNA-seq产百条显著术语时。它为大型基因表达分析提供原则性办法，从通路重叠伪影中指向真信息：聚焦独立富集过程，降冗余与主观选路，提清晰解读、跨研究重现性及下游网络建模、通路优序与假设生成。作为无缝接入已有流程的后富集滤波，PathwayDenester增强PEA实用度。它对富集工具与数据库无关，只需选定基因列表、通路p值及基因成员。凡用输出p值的PEA算法者，皆可以PathwayDenester客观削冗，减手动挑选数，并移除最成问题的搭车通路。

结论（翻译）

通路富集分析（PEA）使研究人员能够通过识别生物学相关通路来解释高通量数据。然而，尽管基因存在广泛重叠，各通路仍被作为独立实体检验。这导致冗余且常具误导性的结果，多个共享许多相同差异表达基因（DEGs）的嵌套通路显得显著，使得研究人员有必要只选择其中一些来关注。即便作者意识到施加偏倚的风险，也很难避免，因为他们缺乏执行此选择的客观标准。

PathwayDenester通过明确考虑通路嵌套解决了这一问题，计算一个p值以区分独立富集的通路，与仅由于结构重叠而显著的通路。正如我们的分析所展示的，它能有效修剪冗余通路，在保留生物学不同过程的同时将结果列表减少约90%。这在PEA工具报告数百个统计显著通路的情境下特别有价值。

在基因表达分析中，尤其是常规产生数百个富集术语的RNA-seq研究，PathwayDenester提供了一种原则性方式，从由通路重叠驱动的伪影中真正指向信息性生物信号。通过识别那些表观富集可由更显著、重叠术语解释的通路，PathwayDenester使研究人员聚焦于独立富集的过程，这些过程更可能代表独特的生物学见解。这不仅减少冗余和主观通路选择，也促进更清晰的生物学解读，提升跨研究的可重现性，并简化下游分析如网络建模、通路优序和假设生成。作为无缝整合进现有流程的后富集滤波步骤，PathwayDenester增强了PEA对大规模基因表达数据集的实际效用。

PathwayDenester方法对所用富集工具或通路数据库不可知，仅需选定基因列表、通路p值和基因成员列表。任何使用输出通路p值算法的PEA者皆可使用PathwayDenester。PathwayDenester可用于客观移除大多数冗余通路，减少必须手动挑选的通路数，最重要的是，移除那些最具问题的通路。