大中东地区隐性遗传病潜在被低估病因的一个例证：整合长读长基因组与转录组长测序锁定GM2神经节苷脂沉积症中HEXB基因深内含子纯合候选始祖变异

《Human Genomics》：An example for potentially underrated causes of recessive disease in the Greater Middle East: integrative long-read genome and transcriptome sequencing pinpoint a deep-intronic homozygous HEXB candidate founder variant in GM2-gangliosidosis

　　

背景：近亲婚配可为鉴定纯合隐性突变提供捷径，但深内含子(deep-intronic)变异会被标准测序（基因包；外显子组/WES）漏检，且其致病性无法仅从基因组数据推断。研究人员在一名生化确诊的GM2神经节苷脂沉积症叙利亚患者中应用了WES、长读长基因组测序(LR-WGS)和长读长RNA测序(LR-RNA-Seq)。结果：未发现HEXA、HEXB和GM2A的外显子突变。LR-WGS/LR-RNA-Seq揭示一处HEXB纯合变异c.771＋985G＞A，其激活了一段97 bp假外显子(pseudo-exon)。结论：整合基因组与转录组测序揭示了深内含子的、数据库已注释的HEXB突变并证实其因果性。这说明中东地区患者因近亲婚配普遍且存在隐匿（候选始祖）突变而面临诊断挑战，此类突变为剪接调节疗法(splice-modulating therapies)的潜在靶点。

该研究发表在《Human Genomics》。研究背景方面，GM2神经节苷脂沉积症（GM2 gangliosidosis）是一类常染色体隐性溶酶体贮积症（lysosomal storage disease, LSD），由β-己糖胺酶（β-hexosaminidase）亚基或GM2激活蛋白（GM2 activator protein, GM2A）编码基因HEXA、HEXB、GM2A突变引起，导致GM2神经节苷脂在神经元溶酶体内进行性蓄积，表现为神经发育障碍与倒退。目前标准诊断流程多采用靶向基因包、全外显子测序（WES）或全基因组测序（WGS），但这些方法对深内含子（deep-intronic）变异检出能力不足，且单纯基因组数据无法判定此类变异是否影响前体mRNA（pre-mRNA）剪接。大中东地区（Greater Middle East, GME）人群近亲婚配率高，隐性致病突变常以纯合状态出现，其中部分深内含子变异及候选始祖突变（founder mutation）易被常规检测遗漏，造成遗传学诊断阴性，但生化指标已提示特定酶缺陷的困境。因此研究人员开展此项研究，旨在通过对生化确诊而WES阴性的叙利亚GM2神经节苷脂沉积症（Sandhoff病，MIM#268800，由HEXB突变所致）患者整合长读长全基因组测序（long-read whole-genome sequencing, LR-WGS）与长读长RNA测序（long-read RNA sequencing, LR-RNA-Seq），定位并功能验证深内含子HEXB变异，明确其致病机制，为类似病例提供诊断范式，并探讨其为剪接调节疗法（splice-modulating therapies）靶点的潜力。结论上，研究人员成功锁定HEXB基因内含子6深处纯合变异c.771＋985G＞A，该变异创建了一个新的剪接受体位点，导致97 bp假外显子（pseudo-exon）被纳入成熟mRNA，引起移码和提前终止密码子（premature termination codon, PTC），从转录水平证实其为功能丧失（loss-of-function, LoF）变异；该成果说明整合长读长基因组与转录组测序是解决深内含子变异致病判定的关键路径，对中大东地区隐性遗传病中被低估的深内含子/始祖突变诊断具有重要意义。

主要关键技术方法：研究人员采集一名叙利亚籍、父母为一级表亲、临床及生化确诊为Sandhoff病（GM2神经节苷脂沉积症2型）的患者及其父母外周血样本（患者用于DNA和RNA分析，父母用于DNA分离分析）。首先用覆盖＞20,000个基因的WES（Roche KAPA HyperExome V1富集，Illumina NovaSeq 6000测序）靶向分析HEXA（NM_000520.6）、HEXB（NM_000521.4）、GM2A（NM_000405.5）等区域；继而用PacBio Revio?系统进行长读长HiFi全基因组测序（LR-WGS，目标HiFi读长≥80 Gb），配合内部生信流程及H3M2工具检测纯合片段（runs of homozygosity, ROH）以评估近亲婚配程度并聚焦HEXB位点；再用Kinnex全长RNA试剂盒进行长读长HiFi RNA测序（LR-RNA-Seq，MAS Seq法，PacBio Revio?）， reads比对至GRCh38，用Integrative Genomics Viewer（IGV）v2.19.4分析剪接异常，并以12例对照归一化看家基因（ATF、POLR2A、ARHGAP1、PRKAG1、ALDOA、ARPC4）比较HEXB表达；同时将患者逆转录cDNA经PCR产物在1%琼脂糖凝胶分析并Sanger测序验证；生化上测定血浆和白细胞β-己糖胺酶总（HEX A＋HEX B）及β-己糖胺酶A（HEX A）活性，并用LC-MS/MS测血浆LysoGM2浓度。

研究结果：“GM2神经节苷脂沉积症（Sandhoff病）在来自近亲叙利亚家庭、有类似病例史的患者”：临床资料显示先证者36月龄起丧失行走能力、语言倒退、全身肌张力低下，两名同胞死于同类病程，父母为一级表亲；生化示血浆LysoGM2显著升高（13.33 nmol/L，参考0–0.5 nmol/L），白细胞HEX A＋HEX B活性严重降低（1.38 mU/mg，参考6.70–26.87 mU/mg），HEX A亦低（0.55 mU/mg，参考1.04–4.97 mU/mg），符合Sandhoff病诊断。“WES后无遗传学诊断”：WES在HEXA、HEXB、GM2A编码区未发现致病变异。“LR-WGS鉴定出HEXB内含子6深处假定剪接突变”：LR-WGS衍生ROH谱（累积ROH 199.3 Mb，ROH比例6.5%）支持近亲婚配；HEXB位于1.3 Mb短ROH内，发现纯合深内含子变异c.771＋985G＞A（GRCh38 chr5:74706305G＞A），多个工具预测其创建新剪接受体位点（SSF 88.79，MaxEnt 5.60，NNSplice 0.41，GeneSplicer 2.84），父母均为杂合携带者，未见HEXA/GM2A罕见 deleterious变异。“LR-RNA-Seq揭示HEXB转录本误剪接并整合移码假外显子”：LR-RNA-Seq获约109 Gb数据，检测到102条HEXB（NM_000521.4）全长转录本（平均读长＞2 kb）；142条含外显子6的读次中134条（94%）因c.771＋985G＞A出现异常剪接，该变异引入新剪接受体并用3′序列作为供体位点，使97 bp内含子6序列成为假外显子；仅8条（5.6%）不含假外显子。“c.771＋985G＞A是功能丧失突变”：97 bp假外显子纳入导致移码，预测产生17个无关残后遇提前终止密码子（p.(Ser259Glufs*18)），蛋白截短至275残（野生型556残）或引发无义介导的mRNA衰变（nonsense-mediated mRNA decay, NMD）；与12例对照比HEXB转录本量无显著下降，但无论截短或NMD均无功能酶；cDNA PCR Sanger测序印证LR-RNA-Seq结果；按ACMG指南评为致病（PVS1支持RNA结果，PM2群体频率极低，PS4_supportive其他患者同源发现）。“c.771＋985G＞A是潜在大中东始祖突变”：ClinVar有3条提交（不确定意义、可能致病纯合Sandhoff、PM3意义杂合/反式致病）；大规模基因组研究报道一名4岁女性纯合者临床符合Sandhoff；dbSNP rs1210377071在gnomAD v.4.1.0仅2例杂合（南亚、非裔美籍），无纯合（152,476等位基因，MAF 1.31e-5）；患者与该南亚携带者（HG03934）HEXB位点SNP至少兼容共享疾病单倍型，提示可能为GME/中东北非（MENA）始祖等位基因，但因常见SNP干扰、缺乏正式单倍型分析、叙利亚与孟加拉国（＞5,000 km）流行数据缺失，尚不能确证；变异位于短ROH（1.3 Mb）与较远祖先相符。

讨论部分总结：研究人员指出，尽管NGS、WES/WGS已成一线检测，但深内含子变异仍逃脱落选编码区方案，而此类变异的剪接影响需转录组（“omics层”）证据；本例中c.771＋985G＞A曾在其他Sandhoff患者中被标注“意义不明”，整合LR-RNA-Seq才足够提升为“致病”，凸显长读长RNA测序（对比短读长）可干净获取全长转录本异构体、更好比对参考、真实反映疾病相关异常剪接（前提是基因在血液等组织表达足够）。深内含子剪接突变是反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides, ASOs）剪接转换个体化疗法的靶点，精确转录水平定性对未来治疗（如Sandhoff尚无根治手段：造血干细胞移植、酶替代、基因疗法未成因果治疗）日益关键；约10%外显子变异实际影响剪接却可能被误标同义/错义，故整合WGS与RNA-Seq是关键诊断路径；长读长HiFi测序在复杂结构变异、难区（假基因、重复富集）优于短读长。大中东地区隐性致病始祖变异占确诊≥30%，纯合常给出捷径但深内含子成陷阱；c.771＋985G＞A在另3例GM2表型中提及（ClinVar、文献）、gnomAD杂合2例、与HG03934可能的共享HEXB单倍型，支持其为候选GME始祖等位基因但待证实；患者此突变在短ROH（1.3 Mb）符合远古起源扩散，长ROH标志近亲/近期始祖；无论是否真正始祖，GME起源GM2神经节苷脂沉积症但标准检测阴性者应排查c.771＋985G＞A_HEXB。该研究例示了GME隐性病中被忽视的深内含子/始祖类病因，这类变异在标准流程下易漏检或错评，却在GME有不可忽略的频率。

结论翻译：整合基因组与转录组测序揭示了深内含子的、数据库已注释的HEXB突变并证实其因果性。这说明中东地区患者因近亲婚配普遍且存在隐匿（候选始祖）突变而面临诊断挑战，此类突变为剪接调节疗法（splice-modulating therapies）的潜在靶点。