prp操纵子在巴氏醋杆菌CGMCC 1.41碳源代谢和乙酸抗性中的功能研究

《BMC Microbiology》：Functions of the prp operon in carbon source metabolism and acetic acid resistance in acetic acid bacteria: a case study in Acetobacter pasteurianus CGMCC 1.41

　　

prp操纵子通常由prpB、prpC、prpD和prpE基因组成，分别编码2-甲基异柠檬酸（2-MIC）裂合酶、2-甲基柠檬酸（2-MC）合酶、2-MC脱水酶和丙酰辅酶A合成酶，这些酶共同构成微生物丙酸代谢中众所周知的2-甲基柠檬酸循环（2-MCC）途径。醋酸菌（AAB）是一类专性好氧的革兰氏阴性微生物。凭借其强大的乙醇氧化和乙酸抗性能力，食醋生产成为AAB重要的工业应用。此前，研究人员首次在巴氏醋杆菌CGMCC 1.41——一种食醋酿造菌株中发现了AAB的prp操纵子，并揭示其在乙酸发酵过程中的上调表达，表明这些基因可能对该菌株的适应性过程具有潜在贡献。在本研究中，研究人员分析了prp基因在AAB中的分布情况，随后构建了六种无痕缺失突变体，以探究这些基因在巴氏醋杆菌CGMCC 1.41碳源代谢和乙酸抗性中的作用。结果表明，缺乏prpE的prp基因簇在醋杆菌属中广泛存在。研究人员还发现，一种编码PrpE同源乙酰辅酶A合成酶的基因被命名为prpE'，该基因参与了许多AAB基因组中假定操纵子的形成。生长实验揭示了巴氏醋杆菌CGMCC 1.41利用丙酸作为碳源的能力，这需要PrpB、PrpC和PrpD的同时参与。研究人员观察到PrpD或PrpB在促进乙醇同化中的作用，而PrpE'似乎对乙醇和乙酸作为碳源的代谢均很重要。PrpB、PrpC和PrpD也对甘油代谢产生积极影响。此外，2-MCC途径的完整性在PrpC催化的生物反应启动时表现出极大的重要性。最后，PrpE'被认为对乙酸抗性过程——乙酸过度氧化至关重要，而PrpD也可能对此过程具有潜在促进作用。

本研究发表于《BMC Microbiology》，旨在探究prp操纵子在醋酸菌中的分布及其功能，特别是在碳源代谢和乙酸抗性中的作用。

研究背景方面，prp操纵子广泛存在于细菌中，通常由prpB、prpC、prpD和prpE四个基因组成，分别编码2-甲基异柠檬酸裂合酶、2-甲基柠檬酸合酶、2-甲基柠檬酸脱水酶和丙酰辅酶A合成酶，这些酶催化的生化反应共同构成2-甲基柠檬酸循环。该途径将丙酰辅酶A和丙酸氧化为丙酮酸，其机制类似于三羧酸循环和乙醛酸途径。2-甲基柠檬酸循环的一个显著特征是其代谢产物的毒性，丙酰辅酶A可抑制丙酮酸脱氢酶、琥珀酰辅酶A合成酶等中心代谢酶，而2-甲基柠檬酸和2-甲基异柠檬酸的毒性也已有报道。醋酸菌是一类专性好氧的革兰氏阴性细菌，具有多种膜结合脱氢酶，能够将多种糖、醇和糖醇不完全氧化为相应的酮、醛和羧酸，称为氧化发酵。其中，乙醇不完全氧化为乙酸的乙酸发酵是醋酸菌最经典的氧化发酵，而乙酸过度氧化被视为醋酸菌重要的乙酸抗性机制之一。此前，研究人员通过转录组分析首次在AAB中发现prp基因簇，巴氏醋杆菌CGMCC 1.41中的相关基因在乙酸发酵过程中均上调表达，且在乙醇氧化中期、第一静止期和乙酸过度氧化期也表现出上调，提示这些基因可能在醋酸菌生理过程中发挥重要作用。然而，prp操纵子在AAB中的分布情况及其具体功能尚不清楚，因此本研究旨在回答这些问题。

研究人员开展了prp基因在511个覆盖所有20个已知属的AAB基因组中的分布分析，并构建了六种无痕缺失突变体（ΔprpD、ΔprpC、ΔprpB、ΔprpE'、ΔprpDCB和ΔprpDCBE'），以探究prp操纵子在碳源代谢和乙酸抗性中的功能。

研究方法方面，研究人员首先利用InterProScan分析获取参考序列的专属InterPro家族ID，通过BLASTp算法在511个AAB基因组中搜索同源序列，并使用OmicsBox软件进行InterPro注释分析。突变体构建采用基于pKOS6b质粒的无痕缺失策略，通过三亲本接合转移将缺失载体导入巴氏醋杆菌CGMCC 1.41，经卡那霉素、头孢西汀和乙酸筛选后，利用5-氟胞嘧啶进行反选择，最终通过PCR和测序验证缺失 genotype。碳源利用实验在BCas合成培养基中进行，分别以丙酸、丙酸钠、乙酸、乙酸钠、甘油、乳酸钠和葡萄糖为唯一碳源，测定OD₆₀₀值。乙酸过度氧化实验在含2%乙醇的GYP培养基中进行，通过频率分布直方图、累积频率曲线和Mann-Whitney U检验分析12个生物学重复的数据。

研究结果显示，prp核心基因（prpB、prpC、prpD）在醋杆菌属中高度普遍，约90%的该属基因组含有全部prp核心基因，但在其他AAB属中相对罕见。值得注意的是，许多AAB的假定prp操纵子中，prpE被acs基因取代，命名为prpE'，这在该类细菌中为首次报道。

丙酸利用实验表明，巴氏醋杆菌CGMCC 1.41能够利用丙酸钠作为碳源，但不能利用丙酸；该过程需要PrpB、PrpC和PrpD的共同参与，缺失任一核心基因均导致丙酸利用能力丧失，表明2-MCC是该菌株唯一的丙酸代谢途径。

乙醇代谢方面，prp核心基因和prpE'均参与乙醇作为碳源的生长利用，其中prpE'作用更为重要。此外，PrpD或PrpB在促进乙醇同化中发挥作用。乙酸代谢方面，缺失prpE'显著降低乙酸和乙酸钠作为碳源时的生长率，表明PrpE'对这两种碳源的代谢至关重要。甘油代谢方面，PrpB、PrpC和PrpD对甘油代谢具有积极影响，而缺失prpE'几乎没有影响。葡萄糖和乳酸钠作为碳源时，各突变体与野生型无显著差异。

2-MCC途径完整性至关重要，PrpC催化的第一步核心反应启动后，缺失prpD或prpB通常导致更严重的生长抑制，提示2-甲基柠檬酸或2-甲基异柠檬酸的积累可能产生毒性。

乙酸过度氧化实验结果显示，野生型菌株的乙酸过度氧化启动时间高度可变，反映出该菌株乙酸抗性的不稳定性。缺失prpE'严重抑制乙酸过度氧化过程，几乎所有样本在培养第7天OD₆₀₀仍未超过3，酸度仍高于2%。prpDCB基因整体对乙酸过度氧化具有促进作用，但PrpC表现出一定的抑制效应，缺失prpC反而促进乙酸过度氧化的启动和进行，可能与其与柠檬酸合酶竞争草酰乙酸底物有关。PrpD在促进乙酸过度氧化中似乎发挥更突出的作用，而PrpB的缺失也导致该过程减弱。这些结果表明PrpE'对乙酸过度氧化至关重要，而prp核心基因中的PrpD和PrpB可能也具有促进功能。

讨论部分，研究人员指出本研究首次系统调查了prp基因在AAB中的分布和功能，揭示了其在醋杆菌属中的广泛存在是该属的特殊特征之一。prp基因的功能不仅限于2-MCC途径和丙酸代谢，还涉及醋酸菌的多种生物学特性，包括乙醇、乙酸和甘油的代谢以及乙酸过度氧化这一重要的乙酸抗性机制。prpE'作为acs基因取代典型prpE的独特存在，其乙酰辅酶A合成酶特性在乙酸代谢和乙酸过度氧化中发挥关键作用，值得进一步通过纯酶实验深入研究。

研究也承认存在局限性，包括样本量相对有限导致部分差异缺乏统计学显著性，以及缺乏代谢通量分析、代谢组学数据和酶学实验等。研究人员建议未来通过同位素标记示踪、细胞内代谢物水平测定、酶底物特异性和动力学分析，以及构建互补菌株和所有基因缺失组合突变体系列，来系统阐释prp基因在AAB中的功能。

研究结论指出，本研究揭示了prp基因簇在AAB醋杆菌属中的广泛分布，其中许多菌株的假定prp操纵子含有acs基因（即prpE'）而非典型prpE。该组基因确实赋予巴氏醋杆菌CGMCC 1.41利用丙酸作为碳源的能力，但其功能并不局限于丙酸分解代谢。研究还证明了这些基因在代谢其他常见碳源（如乙醇、乙酸和甘油）中的促进作用。关于2-MCC途径，其完整性以及prp核心基因的完整性在第一个核心反应启动时表现出显著重要性。同时，PrpE'可能在乙酸抗性机制——乙酸过度氧化中发挥关键作用，该过程似乎也受到PrpD的促进。尽管存在若干局限性，本研究拓展了对AAB背景下prp基因功能的认识，也表明了在进一步研究中对这些基因在该类细菌中进行更全面探究的重要性。