《Horticulture Advances》：Characterization of the PtPHT family in Poncirus trifoliata and identification of a regulatory module, PtRap2.12–PtPHT1;2, under drought stress
编辑推荐：
磷酸盐转运蛋白(Phosphate transporters, PHTs)是H2PO4?/H+转运蛋白，介导无机磷酸盐(Pi)从土壤的吸收及在植物体内的分配。柑橘生产中夏季季节性干旱限制产量并抑制磷(P)吸收，但PHT基因在干旱响应中的作用尚不清楚。本研究在枳
磷酸盐转运蛋白(Phosphate transporters, PHTs)是H2PO4?/H+转运蛋白，介导无机磷酸盐(Pi)从土壤的吸收及在植物体内的分配。柑橘生产中夏季季节性干旱限制产量并抑制磷(P)吸收，但PHT基因在干旱响应中的作用尚不清楚。本研究在枳(Poncirus trifoliata)基因组中鉴定到20个PtPHT基因，基于系统发育关系将其划分为5个亚族(Ⅰ~Ⅴ)。启动子分析发现大量参与非生物胁迫和植物激素响应的顺式作用元件(cis-acting elements)，共线性分析表明基因复制参与了PtPHT家族的扩张。表达谱显示包括PtPHT1;1、PtPHT1;2、PtPHT1;3、PtPHT3;3、PtPHT4;3、PtPHT5;1和PtPHT5;2在内的若干基因受干旱显著上调，其中PtPHT1;2响应最强(约16.4倍)。沉默PtPHT1;2明显降低转基因柑橘愈伤组织的磷积累，证实其参与无机磷酸盐吸收功能。酵母单杂交(Yeast one-hybrid, Y1H)筛选鉴定到AP2/ERF(APETALA2/ETHYLENE RESPONSE FACTOR)类转录因子Related to AP2.12(PtRap2.12)是PtPHT1;2的上游调控因子，Y1H和双荧光素酶(Dual-luciferase, LUC)实验验证PtRap2.12直接结合并激活PtPHT1;2启动子。功能分析显示过表达PtRap2.12增强转基因植株抗旱性，表现为生长改善、膜损伤减轻、抗氧化酶活性升高及磷积累增加；干旱条件下转基因烟草(Nicotiana tabacum)地上部NtPHT1;1和根部NtPHT1;4表达上调。综上，本研究全面解析了枳PtPHT基因家族，阐明PtRap2.12–PtPHT1;2模块协同调控磷酸盐吸收和抗旱性的机制，为培育兼具抗旱与耐低磷能力的柑橘砧木提供理论基础。
《枳PtPHT家族鉴定及PtRap2.12–PtPHT1;2调控模块在干旱胁迫下调控磷酸盐吸收与抗旱性的研究》解读
一、研究背景与立项依据
磷(Phosphorus, P)是植物生长发育必需的大量元素，以无机磷酸盐(Inorganic phosphate, Pi；主要形式为H2PO4?)形式经根系Pi转运蛋白——磷酸盐转运蛋白(Phosphate transporters, PHTs)吸收并分配至各组织器官。柑橘产区常遭受夏季季节性干旱，导致根系活力下降、土壤磷溶解性降低，进而抑制Pi吸收和果实品质形成。目前PHT家族在模式植物中的功能已有报道，按亚细胞定位分为PHT1(质膜Pi吸收与转运)、PHT2(叶绿体)、PHT3(线粒体)、PHT4(高尔基体)和PHT5(液泡膜/SPX-MFS结构域)五个亚族，但其在柑橘尤其是抗旱砧木枳(Poncirus trifoliata)中响应干旱的机制尚不清楚。鉴于干旱诱导的磷饥饿与Pi饥饿响应(Phosphate Starvation Response, PSR)可能存在信号互作，明确PHT基因在干旱下的表达模式及上游调控网络，对选育抗逆、高效吸磷的柑橘砧木具有重要意义。该研究在《Horticulture Advances》发表，系统鉴定枳PtPHT家族并解析AP2/ERF转录因子PtRap2.12对PtPHT1;2的转录激活及其协同提高抗旱与磷吸收的功能。
二、主要关键技术方法
研究人员以枳(Poncirus trifoliata)一年生实生苗为材料进行梯度干旱(控水至不同基质相对含水量RWC)与正常浇水对照处理，取侧根进行转录组测序；以拟南芥(Arabidopsis thaliana) PHT蛋白为查询序列，通过双向BLASTP、保守结构域(CDD)鉴定枳全基因组PtPHT成员，进行系统发育树构建(Maximum Likelihood法)、基序(MEME)、基因结构、染色体分布及物种间共线性(MCScanX)分析；启动子区顺式作用元件用PlantCARE预测；干旱差异表达基因通过RNA-seq与RT?qPCR验证；采用病毒诱导基因沉默(Virus-Induced Gene Silencing, VIGS)在冰糖橙(Citrus sinensis 'Bingtang')愈伤组织中沉默PtPHT1;2并测定总磷(ICP?MS)；以PtPHT1;2启动子为诱饵进行酵母单杂交(Yeast one-hybrid, Y1H)筛库获得上游转录因子PtRap2.12，并用Y1H和点对点验证、烟草(Nicotiana benthamiana)瞬时转化双荧光素酶(Dual-luciferase, LUC)报告系统确认转录激活；将PtRap2.12在本氏烟草(Nicotiana tabacum)中过表达，以10% PEG?6000模拟干旱，测定电导率、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)和过氧化物酶(Peroxidase, POD)及植株磷含量，并检测同源NtPHT1;1/NtPHT1;4表达量。
三、研究结果
Genome-wide identification of PtPHTs in P. trifoliata
研究人员通过生物信息学鉴定枳基因组含20个PtPHT成员(PtPHT1;1~1;7、PtPHT2;1、PtPHT3;1~3;4、PtPHT4;1~4;6、PtPHT5;1~5;2)，氨基酸长度277~757 aa，分子量30.32~83.78 kDa，等电点pI 6.04~9.71；亚细胞定位预测符合各亚族特征(PHT1定位于质膜，PHT2定位于叶绿体等)。表明PtPHT家族在枳中完整存在且具典型理化特征。
Phylogenetic relationships and classification of PHTs
将拟南芥、甜橙(Citrus sinensis)和枳共56条PHT序列建树，20个PtPHT分入PHT1~PHT5五个亚族，其中PHT1亚族最大(7个成员，占35%)，PHT2最小(各物种均1个)。PtPHT与甜橙、拟南芥同源蛋白聚为一支，说明进化上高度保守。提示PHT家族在芸香科植物中功能保守且PHT1为主要根际Pi吸收亚族。
Motif and gene structure analysis of PtPHTs
同一亚族PtPHT蛋白保守基序(Motif)组成与排列高度相似，PHT1基序数最多且顺序一致；基因结构显示PtPHT1外显子少但较长，各亚族含对应保守结构域(PHT1含2A0109磷酸:质子同向转运结构域，PHT5含SPX?MFS等)。证实系统发育分类与结构域特征吻合，PHT1亚族结构最为保守。
Chromosome distribution and synteny analysis of PtPHT genes
20个PtPHT不均匀分布于9条染色体，鉴定到5对片段重复基因对(PtPHT1;1/1;2、PtPHT3;1/3;2等)，无串联重复；与拟南芥有18个、与甜橙有23个直系同源基因对。表明片段重复(Segmental duplication)是PtPHT家族扩张的主要驱动力，且与双子叶植物及近缘柑橘物种PHT基因具有较高共线性。
Analysis of cis-acting elements in PtPHT promoters
启动子区含丰富激素响应元件——脱落酸响应元件(ABRE)、生长素响应元件(AuxRR?core)、茉莉酸甲酯响应元件(TGACG?motif/CGTCA?motif)、乙烯响应元件(ERE)、赤霉素响应元件(GARE/P?box)和水杨酸响应元件(TCA?element)，以及非生物胁迫响应元件——厌氧诱导元件(ARE)、低温响应元件(LTR)、MYB结合位点(MBS)、创伤响应元件(WUN?motif)等，部分基因含多个ABRE或茉莉酸响应元件。提示PtPHT受多种植物激素与非生物胁迫信号共同调控，具备干旱等逆境应答潜力。
Transcriptional profiles of PtPHT genes in response to drought and RT?qPCR validation
转录组显示8个PtPHT上调、8个下调；PtPHT1;2、PtPHT1;3、PtPHT3;3、PtPHT4;3和PtPHT4;5在干旱下上调，PtPHT1;2和PtPHT3;3呈晚期持续上升趋势，PtPHT1;2在中等干旱(RWC 55?65%)上调约16.4倍为最强响应，严重脱水(RWC 11?15%)表达回落；PtPHT5;1和PtPHT5;2全程上调；PtPHT2;1等被抑制。RT?qPCR验证趋势一致。说明不同PHT亚族对干旱有差异化时相响应，PtPHT1;2是干旱下调控磷吸收的关键候选基因。
Silencing PtPHT1;2 reduced the total P content in calli
VIGS沉默PtPHT1;2后愈伤组织PtPHT1;2转录水平显著下降，总磷含量较空载体对照明显降低。证明PtPHT1;2具Pi转运功能，参与柑橘Pi吸收过程。
PtRap2.12 positively regulates PtPHT1;2 expression under drought stress
PtPHT1;2启动子含脱水响应元件(DRE)，Y1H筛库获22个互作蛋白，选AP2/ERF家族PtRap2.12验证：共转PtPHT1;2?pAbAi + PtRap2.12?pGADT7的酵母可在含Aureobasidin A(AbA)培养基生长，阴性对照不能；在本氏烟草中共表达35S::PtRap2.12与proPtPHT1;2::LUC使荧光素酶活性和荧光信号显著升高。表明PtRap2.12直接结合PtPHT1;2启动子并正调控其转录。
Identification and functional analysis of PtRap2.12
PtRap2.12在干旱早期(RWC 17?21%)明显诱导表达后回落；融合蛋白35S::PtRap2.12::GFP定位于细胞核；截短实验显示转录激活域在C端(75 aa N端缺失有活性，90 aa C端缺失无活性)。过表达PtRap2.12的烟草经10% PEG?6000处理10 d后，相比野生型长势更好(株高、冠幅大)，电解质渗漏率和丙二醛(MDA)含量更低，SOD和POD活性更高；地上部NtPHT1;1和根部NtPHT1;4表达分别上调2.68倍和2.07倍，植株地上部和根部总磷含量均高于野生型。说明PtRap2.12是核定位转录激活因子，通过激活PHT1类基因表达协同增强植株抗氧化防御、维持膜稳定性、促进磷吸收从而提高抗旱性。
四、讨论与结论总结
讨论指出，枳作为常用抗旱砧木其PHT家族结构与拟南芥及甜橙保守，片段重复促家族扩张；PHT1亚族为Pi吸收主力，部分成员(PtPHT1;2等)受干旱诱导呈双相表达模式(早期上调后期回落)，与已报道苹果、杨树PHT1;2/PHO9干旱响应相似；AP2/ERF转录因子可通过调控营养转运及胁迫应答基因提高适应性，本研究首次在枳中鉴定到PtRap2.12直接激活PtPHT1;2，形成PtRap2.12–PtPHT1;2调控模块。该模块连接干旱信号传导与磷稳态维持，过表达可提升抗氧化能力、降低膜损伤并促进内源PHT同源基因表达与磷积累。
结论(翻译)：
总之，研究人员在枳中鉴定了20个PtPHT基因并将其划分为5个亚族；RNA?seq分析揭示了这些基因在干旱胁迫下的差异表达模式，其中PtPHT1;2是受干旱强烈诱导并调控磷稳态的关键基因。研究人员进一步证明转录因子PtRap2.12直接结合并激活PtPHT1;2启动子，从而增强磷酸盐吸收和抗旱性。这些发现增进了对柑橘PHT基因在干旱下作用的认识，揭示了此前未被表征的PtRap2.12–PtPHT1;2调控模块，为培育兼具抗旱和低磷耐受性的柑橘砧木提供了潜在遗传靶标。
