体外培养猕猴桃外植体枝条生长动态与空间竞争的三维摄影测量分析

《Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC)》：Three-dimensional photogrammetric analysis of shoot growth dynamics and spatial competition in in vitro–grown kiwifruit explants

　　

由于猕猴桃（Actinidia deliciosa (A.Chev.) C.F.Liang & A.R.Ferguson）常规营养繁殖方法常受限于大面积种植需求、高劳动力投入和 intensive杂草管理，因此，体外微繁殖已成为大规模生产均一、无病原猕猴桃种植材料的有效途径。在本研究中，研究人员以不同外植体密度（3、5和7个）和两种继代培养周期（30天和45天）为条件，研究了体外培养猕猴桃（Hayward品种）的枝条生长动态及外植体间的空间竞争。生长表现通过整合传统测量指标（枝条活力、数量和长度、愈伤组织形成、鲜重和干重生物量）与高分辨率三维摄影测量重建进行评估。图像采集采用基于智能手机的系统（iPhone+viDoc RTK rover），并通过运动恢复结构（Structure from Motion, SfM）摄影测量处理生成密集点云，为定量几何分析提供基础。在30天和45天继代培养后，均观察到人工测量的生长性状与智能手机衍生的形态测量参数之间存在一致的相关性。具体而言，基于点云的表面积、高度和体积估算与枝条数量、枝条长度和生物量积累呈显著相关，支持了三维摄影测量作为体外猕猴桃生长表型组学（phenotyping）非破坏性工具的可靠性。该方法展示了三维摄影测量在提高体外培养系统生长评估客观性、分辨率和可重复性方面的潜力，为枝条发育和密度依赖性相互作用提供了新的见解。

研究背景与问题

猕猴桃（Actinidia deliciosa）是全球最重要的商业水果之一，其中Hayward品种种植面积最广，2023年全球收获面积约286,348公顷，产量约4,433,060.2吨。其经济价值与其丰富的营养成分密切相关，包括多种生物活性化合物、抗氧化物质、维生素和矿物质。猕猴桃可通过有性或无性方式繁殖，但商业栽培基于营养繁殖，因为有性繁殖存在局限性。常规营养繁殖方法如嫁接和硬枝或软枝扦插虽能生产遗传一致的植株，但存在生根率低、劳动强度大、处理时间长等问题，难以满足商业需求的增长。为应对这些挑战，体外组织培养特别是微繁殖（micropropagation）成为大规模繁殖遗传均一、无病原种植材料的有前景的替代方案。该技术可在受控环境中进行大规模生产，不受季节变化影响，并能保持理想农艺性状。然而，优化体外繁殖方案需要高效可靠的方法监测外植体生长和表现。传统体外植物生长监测技术往往具有侵入性、劳动密集型且具破坏性，对完整空间组织的了解有限。尽管非破坏性基于图像的方法近期成为有效替代方案，但大多数常规二维成像方法仅捕捉外植体的投影，无法呈现其完整的三维结构。近年来，激光雷达（LiDAR）和运动恢复结构（SfM）摄影测量等技术的发展使得密集三维点云的重建和单个外植体的详细表征成为可能。本研究正是在此前提下，将传统测量与三维摄影测量分析相结合，首次对体外培养猕猴桃枝条的三维几何特征和形状指数进行了测定。

研究方法与关键技术

研究以猕猴桃Hayward品种为材料，在500 mL玻璃培养瓶中进行体外培养，设置3、5、7个外植体/瓶三种密度和30天、45天两种继代周期。关键技术方法包括：（1）基于智能手机-viDoc RTK Rover系统的高精度图像采集，该系统配备RTK（Real-Time Kinematic，实时动态）定位辅助的GNSS（Global Navigation Satellite System，全球导航卫星系统）天线，与搭载LiDAR传感器的Apple设备配合，通过Pix4Dcatch移动应用程序获取高精度地理参考图像；（2）运用SfM摄影测量工作流在Agisoft Metashape软件中重建三维点云，以已知坐标的棋盘格靶标作为地面控制点（Ground Control Points, GCPs）提高模型精度；（3）在Cyclone 3DR软件中进行点云滤波、分割及几何特征提取，计算枝条高度（h_S）、投影面积（A_S）和体积（V_S）等参数；（4）计算面积-体积比（AV_s）和高度-面积比（HA_s）等形状指数，以及空间重叠度和枝条密度指数（D_s）等空间分布指标；（5）传统破坏性测量包括枝条活力、数量、长度、愈伤组织形成、鲜重和干重等；（6）生根驯化阶段测定存活率、光合速率等参数，采用完全随机设计，进行方差分析和相关性分析。

研究结果

增殖阶段生长表现：外植体活力不受外植体密度和继代培养周期影响，始终维持在100%。枝条产生数量不受初始外植体数量影响，30天时平均2.14条，45天时增至3.63条。平均枝条长度随继代培养时间延长而增加，从11.48 mm升至16.39 mm，7个外植体/瓶处理在45天时值最高。愈伤组织形成百分比不受实验因素影响，接近100%。愈伤组织鲜重、枝条鲜重和总干重均随继代培养时间延长而显著增加。

几何特征与形状指数比较：以面积、高度和体积的相对生长比率评估生长趋势。总体而言，几何扩展程度随外植体数量变化，45天继代培养比30天产生更大的扩展。低密度时重叠最小，高密度时部分水平空间被共同占据。AV_s和HA_s随时间总体呈下降趋势，表明体积相对于表面积的扩展及枝条结构更倾向于水平延伸的趋势。 shoot密度指数在所有配置下均随时间增加，反映枝条对可用空间的渐进占据。

人工测量与点云衍生形态测量参数的相关性：在30天和45天继代培养后均观察到一致性相关。30天时，点云测量的总投影面积（A_stot）和顶视投影面积（A_tw）及估算体积与人工测量的枝条鲜重和总干重呈高度正相关；体积与枝条长度和鲜重相关良好，高度仅与枝条长度相关良好。45天时，A_tw与枝条数量、鲜重及总干重相关，总干重、枝条鲜重和数量与体积相关。

生根驯化阶段：不同增殖处理来源的植株材料在生根驯化阶段未表现出显著差异。存活率普遍较高，超过80%。无论处理如何，植株表现出可比的枝条和叶片发育、根系形成和光合速率。尽管45天继代培养的植株在增殖阶段末期具有更大的枝条长度和鲜重，但这些差异未影响其在后续生根驯化阶段的表现。

讨论

本研究应用三维摄影测量分析研究体外培养猕猴桃外植体的枝条生长动态和空间竞争，并评估继代培养周期和外植体密度对驯化性能的影响。结果表明，培养条件适宜且未对植物材料造成生理胁迫。继代培养周期是影响增殖阶段生长相关参数的主要因素，延长继代培养从30天至45天显著增加枝条数量和长度，以及愈伤组织和枝条鲜重、总干重，这与黑莓和果树砧木中的报道一致，但与牡丹中缩短继代周期提高繁殖效率的结果形成对比。愈伤组织形成在所有处理中均较高，但45天时愈伤组织鲜重增加表明愈伤生长的定量增强而非愈伤发生频率增加，需警惕其可能抑制正常腋芽增殖的风险。

三维点云分析明确显示继代培养周期是影响体外枝条生长的首要因素，45天时相对扩展始终高于30天，反映非线性生长动态。尽管空间重叠随外植体密度增加，但这并未限制枝条生长，表明适度增加外植体数量主要影响空间排列而非整体生长潜力。形状指数显示，与初始测量相比，AV_s和HA_s总体下降而D_s增加，表明结构趋向更紧凑、体积化发展的趋势及更 dense的空间占据。该点云方法相比传统二维或多传感器成像方法，能够实现直接从单一三维重建中进行几何特征和形状描述符的非破坏性、半自动化定量，捕获垂直和体积信息，且成本更低、便携性更强、操作更简便。但需承认的局限性在于，7个外植体/瓶处理在45天时因冠层扩展过度导致无法可靠分离单个枝条，表明该方法对个体枝条水平测量的适用性取决于培养瓶内的冠层闭合程度，最大可接受外植体密度取决于培养周期和物种生长势。

研究结论

总体而言，本研究表明基于智能手机的调查对于表征体外猕猴桃外植体生长是可靠且与传统测量互补的。点云分析准确捕捉植株发育、簇扩展和生物量积累，支持将三维成像整合到高通量表型组学中，以提高准确性、可重复性并减少手工劳动。此外，该方法无需接触枝条即可评估其生长状态，这对于无菌条件下的体外培养尤为重要。该系统的便携性、用户友好性、成本效益以及重复测量的可能性，结合自动化处理，确保了对小对象也能获得一致和可重复的数据。几何生长参数、重叠指标和形状指数的综合分析提供了枝条发育的详细视图，揭示较长继代培养增强生长和结构复杂性，而适度增加外植体密度主要影响空间排列。然而，该方法在高外植体密度和后期培养阶段的冠层闭合情况下仍受限制，突显了改进自动分割程序和标准化图像采集协议以扩展其应用于 dense培养容器的必要性。这些结果表明，三维点云分析是微繁殖表型组学的稳健、非破坏性框架，能够全面表征枝条动态和结构，超越传统二维方法的局限。