《Plant Molecular Biology》：Splicing regulation by RS2Z36 controls ovary patterning and fruit growth in tomato
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果实生长由细胞分裂与细胞扩张介导。在番茄这一肉质果实发育的模式植物中，这两个过程均与基因表达变化紧密相关，包括转录调控和RNA加工。尽管若干转录因子已被证明参与果实发育程序，但剪接调控因子的作用仍在很大程度上缺乏研究。对剪接相关基因进行表达谱分析揭示了其特异性
果实生长由细胞分裂与细胞扩张介导。在番茄这一肉质果实发育的模式植物中，这两个过程均与基因表达变化紧密相关，包括转录调控和RNA加工。尽管若干转录因子已被证明参与果实发育程序，但剪接调控因子的作用仍在很大程度上缺乏研究。对剪接相关基因进行表达谱分析揭示了其特异性表达模式。丝氨酸/精氨酸富集型剪接因子（serine/arginine-rich, SR）RS2Z36在子房以及果实早期发育阶段表达。RS2Z36功能缺失突变导致子房模式建成异常，并形成较小、椭球形果实。rs2z36突变体在开花前（pre-anthesis）子房中表现出沿纵轴方向伸长的果皮（pericarp）细胞，表明依赖RS2Z36的扩张模式在开花（anthesis）之前即已建立。基于RNA测序（RNA-seq）分析，研究人员鉴定出与野生型（WT）相比，rs2z36.1子房中有230个基因表现出改变的剪接谱，另有235个差异表达基因。蛋白质组分析进一步揭示了若干差异丰度异构体，其中包括多种可能参与子房模式建成和果实生长的细胞壁蛋白及其修饰因子。此外，rs2z36-1果皮中LM6识别的阿拉伯聚糖（arabinan）及阿拉伯半乳聚糖蛋白（arabinogalactan protein, AGP）表位沉积增加。综上，这些结果确定RS2Z36是子房和果实发育的调控因子，并强调了剪接控制在塑造果实早期形态中的一种此前未被充分重视的作用。
本文发表于《Plant Molecular Biology》，聚焦于番茄早期果实发育过程中RNA剪接调控的功能。研究背景在于，番茄果实大小和形状的形成依赖子房向果实转变期间细胞分裂与细胞扩张的精细协调，既往研究已较系统地揭示FASCIATED（FAS）、LOCULE NUMBER（LC）、SUN、OVATE等转录调控或形态建成相关基因对果形、心室数和生长方向的作用，但对前体mRNA（pre-mRNA）剪接，尤其是可变剪接（alternative splicing, AS）在这一过程中的贡献认识有限。尽管番茄中约65%的蛋白编码基因发生AS，且AS已被证明与成熟和品质性状有关，但其在开花前后子房发育及果实早期形态建立中的作用长期缺乏直接证据。因此，开展本研究的意义在于从RNA加工层面补充果实发育调控网络，明确剪接因子是否能够作为形态建成的上游调节节点。
研究人员首先对番茄果实不同组织和发育阶段的剪接相关基因进行了全局表达谱分析，发现多类剪接因子呈现明显的组织与时期特异性表达，其中丝氨酸/精氨酸富集型（SR）剪接因子RS2Z36在子房及果实发育早期高表达，因此被选定为功能研究对象。通过CRISPR/Cas9获得的rs2z36功能缺失突变体显示：植株营养生长阶段表型基本正常，但成熟果实明显变小，赤道直径降低，果形指数升高，呈更为椭球化的形态。进一步分析表明，这种表型在开花前的子房阶段即已出现，且突变体子房中果皮细胞沿纵轴方向伸长，提示RS2Z36主要通过影响子房时期的细胞扩张模式而非仅在果实膨大阶段发挥作用。RNA-seq分析显示，rs2z36.1子房中共有230个基因发生差异可变剪接，235个基因发生差异表达；蛋白质组分析则发现大量差异丰度蛋白及异构体，涉及细胞壁、激素代谢和RNA调控等功能类别。免疫荧光结果还表明，突变体子房细胞壁中LM6识别的阿拉伯聚糖/AGP表位增强，LM20识别的高甲酯化同半乳糖醛酸聚糖（homogalacturonan, HG）增加，而LM19识别的去甲酯化HG减少。研究由此得出结论：RS2Z36是调控番茄子房模式建成与果实生长的重要剪接因子，其通过塑造早期细胞扩张和细胞壁状态，参与决定果实正常大小与圆整形态。这一发现的重要意义在于揭示了RNA剪接控制是番茄果实形态建成的重要分子层级，拓展了传统以转录因子和激素信号为核心的果实发育认知框架。
研究采用的关键技术方法主要包括：其一，利用Tomato Expression Atlas数据库对198个剪接相关基因进行共表达聚类分析，筛选候选因子；其二，以番茄Moneymaker为材料，构建CRISPR/Cas9敲除突变体并结合qRT-PCR与原生质体免疫印迹验证RS2Z36失活；其三，对开花前2 d子房样本进行RNA-seq，并用DESeq2和MAJIQ/VOILA分析差异表达基因与差异可变剪接事件；其四，对同阶段子房开展蛋白质组学分析，并结合长读长Iso-Seq剪接异构体库鉴定潜在新型蛋白异构体；其五，通过组织切片、细胞形态测量及LM6、LM19、LM20免疫荧光标记分析细胞壁组分变化。
在研究结果部分，作者首先在“Expression of SR proteins during tomato fruit growth and development”中表明，番茄果实发育过程中，剪接相关基因呈现明显的阶段性和组织特异性表达模式。通过对198个基因的共表达聚类，研究人员获得6个表达簇，提示不同发育阶段可能组装不同组成的剪接复合体。SR蛋白家族成员分布于多个簇中，说明其贯穿多个时期发挥作用，而RS2Z36所在簇在开花后5–10 d出现表达峰值，与细胞分裂结束和细胞扩张启动的关键窗口相吻合，为其参与早期果实发育提供了表达学证据。
在“RS2Z36 is involved in fruit growth”中，研究人员证明RS2Z36缺失直接影响果实大小和形状。CRISPR/Cas9诱导的两个独立rs2z36突变体均形成提前终止密码子（premature termination codon, PTC），其转录本丰度下降，且体外检测未见相应蛋白积累，支持其受到无义介导的mRNA降解（nonsense-mediated decay, NMD）影响。表型测定显示，突变体成熟果实重量下降，赤道直径减小而长度变化不显著，导致果实更加细长；双突变体rs2z35 rs2z36.1果实更小，但果形指数与rs2z36单突变体相近，说明椭球化表型主要由RS2Z36决定。
在“Knowing that RS2Z36 is mainly expressed during the first days after anthesis”这一部分，作者进一步追踪子房时期表型，发现RS2Z36在开花前2 d的表达高于开花当天。对应地，rs2z36突变体从开花前4 d至开花后4 d的子房均表现出更高的子房指数。通过纵切片和细胞形态分析，研究人员观察到突变体子房中果肉层（mesocarp）细胞沿纵向显著伸长，据此证明RS2Z36影响的是早期细胞扩张方向性，这一改变在开花前已建立，并持续影响后续果实外形。
在“RS2Z36-dependent alternative splicing in tomato ovaries”中，RNA-seq结果显示RS2Z36是子房中重要的AS调控因子。研究人员在rs2z36.1与WT比较中鉴定出240个差异可变剪接事件，涉及230个基因，其中以可变3′剪接位点（alternative 3′ splice site selection, A3SS）最为常见，其次为内含子滞留（intron retention, IR）、可变5′剪接位点（A5SS）和盒式外显子（cassette exon, CE）。ΔPSI分布提示，RS2Z36对多数AS事件既可促进也可抑制，但在IR类型上更倾向于作为内含子剪接抑制因子。与叶片数据比较，仅有少数共同靶基因，说明其调控具有器官特异性。差异表达分析还鉴定出235个差异表达基因，但与DAS基因重叠极少，表明RS2Z36的首要功能是调节剪接，而非直接广泛调控转录水平。
在“Proteome analysis for the identification of protein isoforms”中，作者通过蛋白质组学分析发现，RS2Z36突变引起蛋白丰度和蛋白异构体层面的广泛变化。研究人员在已注释蛋白中检测到165个差异丰度蛋白，并借助长读长剪接异构体库进一步识别出来源于449个基因的潜在剪接变体编码肽段，其中部分为差异丰度异构体。尽管DAS基因与差异异构体之间直接重叠极少，尚不能将单一AS事件与特定蛋白变化一一对应，但结果仍表明RS2Z36突变重塑了蛋白质组多样性，特别是涉及细胞壁、激素代谢和RNA调控的蛋白类别，支持剪接改变可通过复杂网络影响发育表型。
在“Immunostaining of cell wall components”中，研究人员将分子层面的变化与细胞壁性质联系起来。基于转录组和蛋白质组中多个细胞壁相关候选基因的变化，作者采用LM6、LM19和LM20抗体对开花期子房切片进行免疫荧光检测。结果显示，rs2z36.1突变体中LM6信号增强且分布更均一，提示阿拉伯聚糖或AGP表位沉积增加；LM19信号减弱而LM20增强，说明细胞壁中HG向较高甲酯化状态转变。该结果表明，RS2Z36缺失与果皮细胞壁可塑性改变相关，这为解释细胞纵向伸长和果形改变提供了组织化学依据。
讨论部分围绕RS2Z36如何将RNA剪接与番茄形态建成联系起来展开。作者认为，RS2Z36在生殖器官中高表达、在营养器官正常条件下低表达，这与其主要影响子房和果实而不显著影响营养生长的表型相一致。其在子房中调控的DAS事件数量高于叶片，进一步支持其组织特异性功能。文中强调，RS2Z36与RS2Z35虽可能在部分背景下协同，但决定椭球形果实的关键因子是RS2Z36。作者还指出，番茄不同发育阶段可能组装不同的剪接复合体，RS2Z36与其他SR蛋白、剪接体亚基及磷酸化调控网络之间的关系值得进一步研究。就功能机制而言，研究未发现SUN、OVATE、SlCCS52A、SlIAA17、SlGA2ox1、SlLIN5、SlHXK1等经典果实发育调控因子是RS2Z36直接靶标，提示其可能通过另一组激素信号、细胞骨架和细胞壁相关基因间接塑造果实形态。作者尤其强调，细胞壁相关变化与表型高度一致：果胶甲酯化状态及阿拉伯聚糖/AGP沉积的改变可能影响细胞壁延展性，进而改变果肉细胞的各向异性扩张，导致较小且更细长的果实。
研究结论部分可译为：本研究确立RS2Z36是控制果实生长与形态的关键剪接因子。尽管尚未建立基因表达、可变剪接与蛋白丰度之间的简单线性联系，但所得数据揭示了一个高度复杂的调控图景，凸显了剪接在发育程序中的整合作用。重要的是，通过将未注释肽段与长读长RNA测序推定的剪接异构体相结合，研究人员鉴定出新的蛋白异构体，显示整合蛋白质组与转录本异构体数据有助于揭示植物基因调控的新层次。综合全部结果，对WT与rs2z36子房的比较支持如下模型：RS2Z36与共表达的剪接因子共同协调激素相关基因、细胞壁相关基因以及转录因子的可变剪接，从而重塑转录组和蛋白质组景观；这些变化进一步调节激素代谢与细胞壁动态，控制果肉层细胞伸长，并最终保证番茄正常生长及多数栽培品种中典型的圆形果实形成。
