巴基斯坦白沙瓦尿路感染来源的多重耐药（MDR）类肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella quasipneumoniae）类肺炎亚种（subsp. quasipneumoniae）分离株的全基因组表征

《Brazilian Journal of Microbiology》：Whole-genome characterization of a colistin-resistant Klebsiella quasipneumoniae subsp. quasipneumoniae isolate from a urinary tract infection in Peshawar, Pakistan

　　

研究人员对类肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella quasipneumoniae）类肺炎亚种（subsp. quasipneumoniae）进行了全基因组表征，该分离株分离自巴基斯坦白沙瓦的一名尿路感染（UTI）患者。类肺炎克雷伯氏菌是肺炎克雷伯氏菌物种复合体（KpSC）内的革兰氏阴性、无动力、有荚膜、兼性厌氧杆菌，日益被认为是一种机会性病原体，可引起血流感染、尿路感染及其他临床显著疾病；因其与肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）共享许多表型特征，在常规临床环境（尤其是缺乏分子鉴定工具的低资源实验室）中准确诊断仍具挑战性。本研究中，研究人员表征了该分离株的抗菌药物耐药（AMR）谱，该分离株表现为多重耐药（MDR）表型，对β-内酰胺类、碳青霉烯类、氟喹诺酮类和粘菌素（colistin，MIC 4 μg/mL）耐药，而对氨基糖苷类（阿米卡星和庆大霉素）和替加环素（tigecycline，MIC 2 μg/mL）敏感。全基因组测序（WGS）鉴定出染色体编码的AMR决定因子，包括blaOKP-A-8、oqxAB和fosA6，未检测到可识别的质粒复制子。在mgrB、pmrA/B、phoP/Q、lpxM、ompK35/36和gyrA/parC中观察到多个错义突变，这些突变既往与耐药表型相关；但其在本分离株中的功能贡献是根据基因组数据推断的，未经实验验证。毒力相关基因座如fim、ecp、entB和fepC存在，与经典（非高毒力）表型一致。系统基因组学分析将该分离株（Kq1223）定位于相对于公开可用基因组的独特分支，但基于单一分离株，不能就区域谱系或进化模式得出确定性结论。多位点序列分型（MLST）鉴定的等位基因谱此前未见报道，在正式数据库验证前可能代表一个未分配的序列类型（ST）。染色体介导的MDR（包括粘菌素耐药）的存在凸显了潜在的治疗挑战，并强调了在临床微生物学中准确鉴定物种及扩大克雷伯氏菌物种基因组监测的重要性，尤其在资源有限的环境中。

研究背景方面，近年来现代医疗发展（广谱抗菌药物广泛使用、住院时间延长、有创操作增多）无意中创造了有利于多重耐药（MDR）和广泛耐药（XDR）病原体出现与传播的生态位。肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）作为ESKAPE病原体组成员，已成为医院获得性及社区获得性感染（肺炎、尿路感染、菌血症、新生儿败血症等）的主要病原；碳青霉烯耐药和产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）的肺炎克雷伯氏菌被WHO列为关键优先级病原体。肺炎克雷伯氏菌物种复合体（KpSC）还包括类肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella quasipneumoniae，分为subsp. quasipneumoniae即KpII-A和subsp. similipneumoniae即KpII-B）、变栖克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）等，常规表型方法（API 20E、VITEK、MALDI-TOF MS）常无法区分，导致物种特异性流行病学、毒力和AMR模式被低估。类肺炎克雷伯氏菌最初被视为环境种，现证实可引起血流、尿路、伤口感染等，尤其免疫低下宿主；它能通过水平基因转移获得ESBL和碳青霉烯酶基因（bla_NDM、bla_KPC、bla_OXA-48等），是KpSC中MDR决定的潜在储库，但染色体与质粒介导耐药的贡献尚不完全清楚。粘菌素（colistin）作为MDR革兰氏阴性菌感染的最后一线药物，耐药性上升主要由染色体突变（mgrB、pmrA/B、phoP/Q、lpxM等）或质粒介导的mcr基因驱动；粘菌素耐药在肺炎克雷伯氏菌中已有充分记载，但在类肺炎克雷伯氏菌中报道较少，分子机制未完全阐明。巴基斯坦对碳青霉烯耐药肺炎克雷伯氏菌（携带bla_NDM、bla_OXA-48）有较多记录，但白沙瓦地区类肺炎克雷伯氏菌的基因组数据极度缺乏。因此研究人员开展本研究，对一个来自白沙瓦UTI患者的粘菌素非敏感类肺炎克雷伯氏菌类肺炎亚种分离株Kq1223进行WGS表征，描述其AMR决定因子、毒力基因座和系统发育关系，为这一代表性不足地区的KpSC多样性提供初步基因组见解，强调需扩大基因组监测和功能性研究。

本研究主要关键技术方法：研究人员收集2024年8月至2025年7月巴基斯坦白沙瓦三家三级医院（Lady Reading Hospital、Khyber Teaching Hospital、Hayatabad Medical Complex）的临床样本共600份（血、尿、痰、脓液、伤口拭子及其他体液），初筛鉴定出64株克雷伯氏菌属（Klebsiella spp.）；药敏试验采用Kirby–Bauer纸片扩散法（按CLSI2023）和肉汤微量稀释/Etest（粘菌素、替加环素）；从中选取25株（13株MDR、12株XDR，基于高质量基因组DNA）进行全基因组测序（Illumina MiSeq，150 bp双端，约100×覆盖度）；生物信息学流程包括Fastp质控、Shovill（SPAdes）de novo组装、Prokka注释、Kraken分类、FastANI种水平鉴定（以K. quasipneumoniae subsp. quasipneumoniae 01A030^T和K. pneumoniae subsp. pneumoniae HS11286为参考）、ResFinder和CARD进行AMR基因分析、AMRFinderPlus确认染色体耐药点突变、VFDB毒力基因分析、PlasmidFinder质粒复制子筛查、多位点序列分型（MLST）、CRISPRFinder鉴定CRISPR–Cas系统；系统发育分析基于BV-BRC细菌基因组树服务（100个保守单拷贝核心基因建树），用MEGA11和iTOL可视化；统计用STATA分析耐药表型频率。

研究结果部分，各小标题及结论如下：

临床与队列人口学特征：64株克雷伯氏菌分离株来自白沙瓦三家三级医院2024年8月–2025年7月的病人，中位年龄57岁，62.5%为男性，71.9%为普什图族，常见合并症为2型糖尿病（34.4%）、慢性肾病（21.9%）、高血压（20.3%）；感染部位以皮肤软组织（34.4%）、伤口（28.1%）、尿路（14.1%）为主，血流感染较少（4.7%）。此部分代表整体克雷伯氏菌队列，非特指Kq1223。

抗菌药物敏感性谱：64株中，34.4%为MDR、18.8%为XDR（按Magiorakos等2012标准，因未测全类别抗菌药故为暂定分类），无全耐药（PDR）；替加环素（87.5%）和粘菌素（84.37%）最有效；氨基糖苷类中阿米卡星（64.1%）优于庆大霉素（51.6%）；美罗培南有效75%；β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂复方哌拉西林–他唑巴坦（70.3%）、头孢哌酮–舒巴坦（67.2%）活性尚可；头孢菌素中头孢噻肟低（40.6%），头孢他啶（53.1%）和头孢吡肟（54.7%）中等；头孢他啶–阿维巴坦65.6%（但＞1/3耐药）；环丙沙星51.6%有限；四环素最低（28.1%）。

Klebsiella谱系鉴定 via WGS：25株KpSC分离株WGS后，ANI分析显示24株为肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种（K. pneumoniae subsp. pneumoniae），1株（Kq1223）与K. quasipneumoniae subsp. quasipneumoniae 01A030^TANI为99.02%，与肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种HS11286为93.84%，据此明确归为类肺炎克雷伯氏菌类肺炎亚种；基于单一分离株，结论为描述性而非群体代表性。

Kq1223临床与微生物学特征：分离自56岁女性，有2型糖尿病、高血压、慢性肾病史，表现为发热、排尿灼痛、气短，诊断为UTI；AST显示Kq1223对美罗培南、哌拉西林–他唑巴坦、头孢哌酮–舒巴坦、阿莫西林–克拉维酸、头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、环丙沙星、四环素、头孢他啶–阿维巴坦、粘菌素非敏感（粘菌素MIC=4 μg/mL，替加环素MIC=2 μg/mL，均用肉汤微量稀释测定）；对氨基糖苷类和替加环素敏感；跨多抗菌类别耐药谱符合MDR。

基因组特征：Kq1223基因组大小5.37 Mb，GC含量57.95%，组装为98个contigs，N50=365,211 bp，L50=5；注释得到5227个编码序列、86个tRNA、13个rRNA操纵子；MLST等位基因谱为gapA[17]、infB[19]、mdh(156)、pgi(331)、phoE(207)、rpoB[21]、tonB(589)，该谱在现有MLST数据库中未见报道，属未分配序列类型（待正式提交验证）。

AMR决定因子：基因组仅检出4个染色体编码固有耐药基因：blaOKP-A-8_1（OKP型β-内酰胺酶，对青霉素低水平耐药，非ESBL）、oqxA_1/oqxB_1（OqxAB外排泵，介导氟喹诺酮、氯霉素等固有耐药）、fosA6_1（谷胱甘肽转移酶，低水平磷霉素耐药）；未检出已知质粒复制子（PlasmidFinder）和获得性AMR基因（ResFinder），但不排除未表征的隐蔽/低拷贝移动元件；染色体耐药相关基因座发现多个错义突变：pmrA（S2P、R88K等）、pmrB（L105Q等）、phoQ（P140L等）、mgrB（Q2无义、E5K、插入等）、lpxM（I36T等）关联粘菌素耐药（脂质A重塑、负电荷减少）；ompK35（W108终止等）、ompK36（G230D等）关联碳青霉烯敏感性降低（外膜通透性下降）；gyrA（S83I、D87N等）、parC（S80I等）关联氟喹诺酮耐药（DNA促旋酶/拓扑异构酶IV喹诺酮耐药决定区突变）；上述基因型–表型关联由基因组数据与文献推断，未进行互补、转录、脂质A表征等功能验证。

毒力决定因子：检出保守但有限的毒力谱：ompA、entB、fepC（黏附、铁摄取、血清抵抗相关）；ykgK/ecpR、yagZ/ecpA（大肠杆菌常见菌毛ECP操纵子组分，中度黏附和生物膜形成潜力）；未检出高毒力基因座（rmpA、iuc、ybt等），支持为经典（非高毒力）机会性菌株。

系统发育定位：全基因组系统树（100个核心基因）将Kq1223置于类肺炎克雷伯氏菌类肺炎亚种分支内，与现有公开基因组（来自9国2010–2024年，35个）比较，Kq1223成独立分支，最近缘为HKU6（香港）和UCICRE14（美国）；在KpSC广义树中，Kq1223清晰聚类于类肺炎亚种支，与肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种、变栖克雷伯氏菌分开（bootstrap=100%）；单一分离株不能推定区域谱系或进化轨迹，可能反映南亚采样不足。

CRISPR–Cas系统：鉴定出两个CRISPR阵列：CRISPR1（11,809–11,959 bp，2个spacer，重复保守96.8%）、CRISPR2（20,664–21,179 bp，8个spacer，重复保守87.4%），关联完整I-E型Cas基因簇（cas1–cas7、cse1–cse2、cas3），提示具适应性免疫机制限制外来遗传元件；未做spacer–原间隔匹配分析，功能活性未定；完整CRISPR–Cas与未检出质粒的可能关系仅为推测。

讨论部分总结：类肺炎克雷伯氏菌自2014年确立为KpSC成员，临床相关性上升（UTI、BSI、胆道、呼吸道感染，尤住院/免疫低下者），但基因组数据全球有限（多来自中、美、巴西等），本研究提供巴基斯坦白沙瓦首例WGS表征的单分离株Kq1223，属描述性基因组报告而非群体流行病学。WGS（ANI）准确鉴定为类肺炎亚种，凸显表型方法（API 20E等）无法区分KpSC成员，临床需基因组手段（ANI、WGS分类）。Kq1223的耐药组主要为染色体编码（blaOKP-A-8、fosA6、oqxA/B），无检出质粒复制子和获得性AMR基因（如bla_NDM、bla_SHV、bla_CTX-M、mcr等），粘菌素非敏感由染色体突变（mgrB无义/错义、pmrA/B、phoQ、lpxM等，关联脂质A修饰）推测，碳青霉烯低敏由ompK35/36突变（外膜孔蛋白缺失/改变）推测，氟喹诺酮耐药由gyrA/parC QRDR突变推测；但这些基因型–表型因果关系仅由基因组推断，未功能验证（无互补、转录、蛋白表达、脂质A表征），部分突变可能是谱系多态而非因果耐药；其他机制（外排、调控、荚膜效应）也可能参与。毒力基因为经典机会型（entB、fepC、ecp等），无高毒力决定子（rmpA、iuc、ybt），与非高毒力表型一致。检出完整I-E型CRISPR–Cas，但未分析spacer匹配，与“无质粒”的关联属推测，不能排除既往基因转移或未检出隐蔽元件。系统发育显示Kq1223在类肺炎亚种内成独特分支（近HKU6、UCICRE14），但单分离株不能代表区域谱系，更可能反映南亚采样不足；需更大样本、泛基因组、比较基因组、纵向监测来明确该类肺炎克雷伯氏菌在南亚的种群结构、耐药演化与多样性。局限包括：单分离株无法推群体流行/传播/结构；耐药突变无功能验证；未做泛基因组/附属基因组/移动元件精细分析；未检出质粒不等于无隐蔽移动元件。结论：本研究通过WGS准确鉴定巴基斯坦白沙瓦UTI来源的粘菌素非敏感类肺炎克雷伯氏菌类肺炎亚种Kq1223，其MDR主要由染色体介导（耐药基因blaOKP-A-8、fosA6、oqxA/B及染色体点突变mgrB、pmrA/B、phoQ、lpxM、ompK35/36、gyrA/parC等推测关联粘菌素/碳青霉烯/氟喹诺酮耐药），无检出质粒复制子和获得性AMR基因（不排除未表征元件），毒力谱为经典非高毒力型，具完整I-E CRISPR–Cas，系统发育在类肺炎亚种内独特分支；结果为代表性不足地区提供初步基因组见解，强调临床需准确物种鉴定及扩大KpSC基因组监测，但基于单分离株属探索性发现，需扩大采样与功能研究验证。