《Functional & Integrative Genomics》：Peripheral and central immune features in insomnia: Integrative bulk and single-cell transcriptomic analyses reveal core hub genes and candidate compounds
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研究人员旨在阐明失眠相关的外周-中枢免疫失衡模式及其分子基础。研究利用外周血bulk转录组数据集GSE208668进行差异表达分析、加权基因共表达网络分析（WGCNA）及功能富集分析，以识别失眠相关基因；继而通过蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析及机器学
研究人员旨在阐明失眠相关的外周-中枢免疫失衡模式及其分子基础。研究利用外周血bulk转录组数据集GSE208668进行差异表达分析、加权基因共表达网络分析（WGCNA）及功能富集分析，以识别失眠相关基因；继而通过蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析及机器学习模型在独立外周血数据集中筛选核心基因。研究人员采用免疫反卷积及外周血单细胞转录组数据集GSE213496解析这些基因的免疫细胞背景、细胞类型定位及细胞间通讯特征；并进一步分析脑单细胞转录组数据集GSE137665以评估中枢改变。通过药物预测、分子对接及分子动力学模拟优先筛选候选化合物，后续在脂多糖（LPS）诱导的THP-1巨噬细胞模型中对白藜芦醇进行体外验证。研究共鉴定出5,321个与失眠相关的差异表达基因，WGCNA分析突显turquoise模块与blue模块为关键失眠相关模块。整合分析获得390个交集基因，主要富集于免疫、炎症及氧化应激相关通路。PPI分析与机器学习进一步确定六个精炼核心基因：FN1、HMOX1、HSP90AA1、IL10、MYD88及NFE2L2。由于IL10在单细胞数据集中未能稳定检出，后续单细胞分析采用其余五个基因。免疫反卷积提示失眠存在选择性外周免疫重塑，表现为静息CD4记忆T细胞及M2巨噬细胞增加、活化NK细胞减少。外周单细胞分析显示HMOX1、HSP90AA1、MYD88及NFE2L2主要富集于中性粒细胞、炎性巨噬细胞、常规树突状细胞及特定淋巴细胞群体，而FN1呈现更为受限的分布模式。CellChat分析表明睡眠剥夺相关条件下细胞间通讯增强。相比之下，脑单细胞分析揭示中枢改变相对温和但可检测，包括室管膜细胞富集、兴奋性神经元轻度增加、脑内皮细胞及脉络丛基质成纤维细胞增多，同时核心枢纽基因呈异质性表达且脑内通讯网络发生选择性重塑。药物预测一致性地将槲皮素与白藜芦醇列为优先候选，结构分析支持其与关键靶点的稳定相互作用。在THP-1巨噬细胞中，白藜芦醇下调MYD88与HSP90AA1表达，同时进一步上调HMOX1。研究提示失眠主要与外周为中心的免疫失衡模式相关，其特征为固有免疫相关群体的选择性重塑、炎症与氧化应激程序增强及细胞间通讯增加；MYD88-HMOX1-HSP90AA1-NFE2L2轴可能代表连接炎症激活与氧化应激适应的关键分子程序。白藜芦醇被识别为潜在化合物并经初步体外实验验证。
**研究背景与问题提出**
失眠是全球最常见的睡眠障碍之一，以入睡困难、睡眠维持障碍或早醒为核心特征，全球患病率约为16.2%。慢性失眠不仅损害注意力、情绪及认知功能，还与抑郁、焦虑、心血管疾病、代谢综合征及神经退行性疾病密切相关。当前治疗以认知行为疗法及苯二氮?类、褪黑素、GABA能药物等药理干预为主，但主要靶向神经传导与觉醒调节，长期应用受限于不良反应及依赖风险，这提示需从更广泛的生物学框架理解失眠病理生理机制。
近年来神经免疫学进展修正了传统脑作为"免疫豁免器官"的观点。中枢神经系统（CNS)通过脑膜、血脑屏障(BBB)、脉络丛及脑膜淋巴通路等神经免疫界面与外周免疫系统持续进行分子交换和功能互作。神经元可通过白细胞介素-13(IL-13)相关细胞因子信号通路调控免疫应答，免疫细胞亦能感知神经递质和神经肽；脑膜和脉络丛富含T细胞、B细胞、树突状细胞及巨噬细胞，可感知脑脊液信号并传递组织稳态或免疫激活信息。这种"神经免疫生态系统"为超越纯神经模型的失眠研究提供了理论基础。
既有证据从中枢和外周层面均提示免疫失调参与睡眠相关病理过程。中枢层面，单细胞及类器官研究表明小胶质细胞可响应外周炎症信号并影响神经网络重塑；实验性睡眠剥夺与TREM2依赖性小胶质细胞激活及β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积增加相关。外周层面，慢性失眠常伴IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-1β等炎症介质升高及抗氧化能力下降。外周免疫信号可通过体液途径或神经反射通路影响CNS，而中枢免疫激活也可能反过来影响外周免疫调节。然而，既往研究多仅聚焦于循环细胞因子、氧化应激标志物或小胶质细胞反应的单一层面，尚未系统阐明连接外周免疫改变与中枢神经免疫变化的分子网络和细胞程序。
基于此，研究人员开展了一项整合外周血bulk转录组、外周及脑单细胞转录组数据的多层次研究，旨在刻画失眠在外周和中枢水平的免疫学特征，识别关键免疫细胞群体和核心分子程序，并预测候选治疗化合物进行初步实验验证。该论文发表于《Functional & Integrative Genomics》（注：根据上下文推断，用户提及"《Functional》"应为该期刊的简写或笔误）。
**关键技术方法**
研究采用的技术路线主要包括：差异表达分析与加权基因共表达网络分析(WGCNA)用于发现队列（GSE208668，17例失眠 vs 25例对照）的失眠相关基因识别；PPI网络构建结合CytoHubba拓扑算法（MCC、MNC、EPC、Degree）筛选枢纽基因；20种机器学习模型（包括glmBoost、随机森林、支持向量机、XGBoost等）及SHAP可解释性分析在独立外周血数据集（GSE56931作为训练集、GSE37667作为验证集）中精炼核心基因；CIBERSORT免疫反卷积解析外周免疫组成；Seurat包分析小鼠外周血单细胞数据集GSE213496（对照组vs睡眠剥夺组）及脑单细胞数据集GSE137665（皮层、下丘脑、脑干，含Normal Sleep与Sleep Deprived各3例）；CellChat进行细胞间通讯分析，CytoTRACE2评估分化状态；基于核心基因的药物预测、AutoDock Vina分子对接及GROMACS分子动力学模拟（100 ns）；最后采用LPS诱导的THP-1巨噬细胞模型进行白藜芦醇的CCK-8细胞毒性、Western blot及qRT-PCR体外验证。
**研究结果**
**外周血差异表达基因与WGCNA分析：** 在GSE208668中发现队列中鉴定出5,321个差异表达基因(DEGs)。WGCNA以软阈值power=12构建符号共表达网络，确定turquoise模块（与失眠正相关最强）和blue模块（与失眠负相关最强）为关键失眠相关模块，模块特征基因分析显示turquoise模块在失眠组显著升高、blue模块显著降低，基因显著性与模块隶属度呈强相关性。
**枢纽基因与精炼核心基因识别：** 取DEGs、WGCNA模块基因及GeneCards失眠相关基因的交集，获得390个交集基因，主要富集于NF-κB、Toll样受体、NOD样受体等免疫、炎症及氧化应激相关通路。PPI网络分析结合四种拓扑算法交集确定9个枢纽基因。经机器学习模型性能、跨模型复发频率及SHAP解释性综合评估，最终确定FN1、HMOX1、HSP90AA1、IL10、MYD88、NFE2L2为精炼核心基因，其中HMOX1、HSP90AA1、IL10、MYD88、NFE2L2在失眠组显著上调。单基因GSEA提示这些基因主要与免疫激活和应激反应通路相关。
**外周免疫细胞背景解析：** CIBERSORT sioux146 Immune deconvolution揭示失眠组选择性外周免疫重塑特征：静息CD4记忆T细胞和M2巨噬细胞增加，活化NK细胞减少。在外周血单细胞分析中，因IL10未被稳定检出，FN1、HMOX1、HSP90AA1、MYD88、NFE2L2被定为下游分析的核心枢纽基因。该数据集鉴定出11个免疫细胞群体，睡眠剥夺组显示驻留巨噬细胞、组织驻留CD8
+ T细胞、中性粒细胞、初始CD4
+ T细胞、炎性巨噬细胞、滤泡B细胞、CD4
+辅助T细胞比例相对增高，常规树突状细胞(cDCs)减少。核心枢纽基因表达模式显示：FN1主要定位于驻留巨噬细胞，其余四基因优先表达于巨噬细胞、中性粒细胞、cDC及特定淋巴细胞群体；睡眠剥夺条件下HMOX1、HSP90AA1、MYD88、NFE2L2在中性粒细胞和炎性巨噬细胞中分布更广。CellChat分析显示睡眠剥夺组推断配体-受体相互作用数量和强度均增高，通讯网络更为密集，中性粒细胞成为主要通讯枢纽；而CytoTRACE2分析未显示明显分化层级差异。
**脑单细胞分析：** 对GSE137665经Harmony校正后鉴定11个CNS细胞群体。组间比较显示室管膜细胞富集，兴奋性神经元、脑内皮细胞及脉络丛基质成纤维细胞轻度增加。核心枢纽基因在脑中呈异质性表达：FN1主要富集于内皮和脉络丛相关区室，HSP90AA1和NFE2L2表达较广泛，HMOX1和MYD88整体较弱；多数基因未显示明显组间差异。CellChat网络识别脑内皮细胞和兴奋性神经元为主要通讯枢纽，谷氨酸能信号、Apoe/App相关信号及多种生长因子相关通路构成显著通讯轴。
**药物预测、结构分析与体外验证：** 药物预测从精炼核心基因和核心枢纽基因模型中一致筛选出槲皮素和白藜芦醇。分子对接显示两化合物与五种核心枢纽蛋白均有利结合（结合能<-5.0 kcal/mol），槲皮素与NFE2L2结合最强（-10.0 kcal/mol）。分子动力学模拟证实NFE2L2-槲皮素、NFE2L2-白藜芦醇、HSP90AA1-槲皮素、HSP90AA1-白藜芦醇复合物在100 ns模拟中达到动态平衡，RMSD、Rg、SASA稳定，维持持续氢键相互作用。CCK-8确定25 μM白藜芦醇为工作浓度；在该浓度下，LPS诱导的THP-1巨噬细胞中，白藜芦醇显著下调MYD88和HSP90AA1蛋白及mRNA表达，同时进一步上调HMOX1表达。
**讨论与结论**
研究人员提出失眠主要与"外周为中心的免疫失衡模式"相关，而非简单的全脑性神经免疫紊乱。研究支持的关键论点包括：失眠相关改变主要表现为外周水平的选择性固有免疫细胞群体重塑、炎症与氧化应激程序并行激活但动态失衡、以及细胞间通讯增强而非全面免疫激活；MYD88-HMOX1-HSP90AA1-NFE2L2轴构成连接炎症激活与氧化应激适应的核心分子程序；FN1可能代表与细胞外基质组织及组织界面重塑相关的独立生物学维度。
原文研究结论部分指出（翻译）："Insomnia appears to be associated predominantly with a peripheral-centered immune disequilibrium pattern, characterized by selective remodeling of innate immune-related populations, enhanced inflammatory and oxidative stress programs, and increased intercellular communication. The MYD88-HMOX1-HSP90AA1-NFE2L2 axis may represent a key molecular program linking inflammatory activation and oxidative stress adaptation. Resveratrol was identified as a potential compound and has been validated through preliminary in vitro experiments."（失眠主要与外周为中心的免疫失衡模式相关，其特征为固有免疫相关群体的选择性重塑、炎症与氧化应激程序增强以及细胞间通讯增加。MYD88-HMOX1-HSP90AA1-NFE2L2轴可能代表连接炎症激活与氧化应激适应的关键分子程序。白藜芦醇被识别为潜在化合物并经初步体外实验验证。）
研究同时承认若干局限性：外周bulk数据源自人样本而单细胞数据来自小鼠睡眠剥夺模型，存在物种差异；脑单细胞数据集仅反映约12小时急性睡眠剥夺，而外周血数据集对应24/48小时，时间窗口不匹配可能低估中枢改变；脑数据集主要来自脑实质，可能稀释了脑膜、脉络丛等脑边界区的局部改变；IL10因单细胞平台检测灵敏度限制未能稳定检出，但不排除其生物学相关性。未来研究需采用匹配的外周-中枢采样设计、更长观察窗口及更高解剖分辨率的单细胞或空间组学分析，尤其关注脑边界区室、神经血管接口和免疫细胞状态转换。
