秋水仙碱诱导的Stevia rebaudiana Bertoni四倍体：一种优化的基于种子的培养方案及其细胞遗传学、形态生理学和甜菊糖苷特性的研究

《Journal of Applied Research on Medicinal and Aromatic Plants》：Colchicine-induced tetraploids of Stevia rebaudiana Bertoni: an optimized seed-based protocol and cytogenetic, morphophysiological and steviol-glycoside characterization

　　

Leila Taheri|Payam Pour Mohammadi|Karim Sorkheh Tamimi

胡齐斯坦农业科学与自然资源大学植物生产与遗传学系，伊朗阿瓦兹省莫拉萨尼

摘要

Stevia rebaudiana Bertoni 是天然零卡路里甜味剂——斯蒂维醇苷的重要来源，但由于其高度遗传异质性和低种子发芽率，其遗传改良面临挑战。本研究旨在开发一种高效的基于种子的秋水仙素处理方案，以诱导稳定的自体四倍体，并全面评估其在药用植物生物勘探方面的细胞遗传学、形态生理学和植物化学变化。表面消毒后的萌发种子在因子完全随机设计下用秋水仙素（0–1.0% w/v）处理6–48小时。初步通过形态学和气孔特征筛选出疑似多倍体，然后通过流式细胞术和染色体计数进行确认。最佳处理条件（0.4% 秋水仙素处理24小时）使四倍体诱导频率达到20–25%，幼苗存活率为52.5%。四倍体（2n = 4x = 44）表现出特征性的巨型细胞特征，包括较大的保卫细胞（10.3 μm vs 5.0 μm）、较低的气孔密度（约30 mm?2 vs 70 mm?2）、增加的叶片厚度（0.62 mm vs 0.35 mm）以及更高的叶绿素含量。高效液相色谱（HPLC）分析显示，四倍体中的斯蒂维醇苷（54.8 mg·g?1 DW vs 45.2 mg·g?1 DW）和雷巴乌迪苷A（36.5 mg·g?1 DW）含量显著更高。这种优化且可扩展的方案为生成具有优良农艺和代谢特性的四倍体种质提供了实用方法，证明了多倍体技术在药用植物高级育种和生物改良中的实用性。

部分摘录

引言

Stevia rebaudiana Bertoni（菊科植物）是一种具有商业价值的药用植物，其二萜类斯蒂维醇苷（主要是斯蒂维醇苷和雷巴乌迪苷A）作为天然零卡路里甜味剂，全球需求迅速增长（Lemus-Mondaca等人，2012年）。传统育种方法的进展受到种子群体高遗传异质性和不规则有性繁殖的限制，导致叶片产量不稳定和苷类成分变化较大。

植物材料

Stevia rebaudiana Bertoni 的认证种子（编号IBRC P1010920）来自伊朗国家遗传与生物资源中心。种子在4°C下保存直至使用。

实验设计与秋水仙素处理

实验采用两因素因子设计（秋水仙素浓度 × 处理时间），完全随机设计（CRD），重复四次。每个实验单元包含30粒表面消毒的种子。

秋水仙素处理： 使用Sigma-Aldrich公司的分析级秋水仙素

形态学和气孔特征

形态学和气孔特征的结果见表1，并在图1中展示。四倍体植物与二倍体对照相比表现出一致且统计学上显著的变化。从叶背表皮印迹测得的气孔数据显示，四倍体的保卫细胞明显较大：四倍体的平均气孔长度为10.3 ± 0.3 μm，而二倍体为5.0 ± 0.2 μm（平均值 ± 标准误差；每倍性类别10株植物；ANOVA p < 0.01）。

讨论

本文优化的基于种子的秋水仙素处理方法（0.4% 秋水仙素处理24小时）为诱导Stevia rebaudiana中的稳定自体四倍体提供了一种实用且可重复的方法。这种方法与其他药用植物的成功应用一致，其中种子处理已被证明能有效生成遗传多样性的多倍体群体（Surson等人，2024年；Manzoor等人，2019年）。流式细胞术和有丝分裂染色体计数结果均证实了基因组加倍。

结论

我们建立并优化了一种可靠的基于种子的秋水仙素诱导Stevia rebaudiana Bertoni自体四倍体的方法。最佳处理条件（0.4% 秋水仙素处理24小时）有效平衡了诱导效率与幼苗存活率，得到了存活率为52.5%的四倍体群体。通过使用Pisum sativum ‘Ctirad’作为内标结合流式细胞术和有丝分裂染色体计数，确定了倍性水平。

伦理批准

不适用。

资金支持

本研究得到了胡齐斯坦农业科学与自然资源大学的支持。资助方未参与研究设计、数据收集与分析、发表决定或手稿准备。

CRediT作者贡献声明

Karim Sorkheh Tamimi： 数据可视化、软件、方法学。Payam Pour Mohammadi： 文章撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、监督、资源管理、项目协调、方法学研究、资金申请。Leila Taheri： 形式分析、数据管理、概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

作者衷心感谢胡齐斯坦农业科学与自然资源大学的财政支持。同时感谢植物生产与遗传学系的实验室工作人员提供的技术协助。作者声明不存在利益冲突。

无。

作者声明没有财务或非财务上的利益冲突。

不适用。

不适用。