FTO通过调控VGLL4的m6A水平激活STAT3信号通路，从而促进三阴性乳腺癌进展

《Journal of Biological Chemistry》：FTO Promotes Cancer Progression by Regulating VGLL4 m6A Levels to Activate STAT3 Signaling in Triple-Negative Breast Cancer

　　

三阴性乳腺癌（TNBC）是一种高度侵袭性的恶性肿瘤，具有不良预后和较高死亡率。近年来研究表明，N⁶-甲基腺苷（m⁶A）修饰在癌症进展中具有关键作用，然而m⁶A调控因子FTO在TNBC中的具体功能仍不清楚。本研究从GEO数据集获得临床样本中FTO的表达信息，并分析FTO表达与患者临床病理参数之间的相关性。研究人员采用MTT、克隆形成、划痕愈合、Transwell实验以及体内成瘤实验，探讨FTO对TNBC细胞生物学行为的影响。采用qRT-PCR、免疫组织化学（IHC）和蛋白质印迹（WB）检测FTO在TNBC中的表达水平；采用转录组测序、m⁶A-RNA免疫沉淀（MeRIP）、RNA免疫沉淀（RIP）和RNA稳定性实验探究FTO调控的潜在机制。研究证实，FTO在TNBC组织中高表达。此外，FTO高表达与TNBC患者较差预后相关。功能实验表明，FTO过表达促进TNBC细胞增殖和迁移。体内研究表明，FTO过表达促进TNBC细胞肿瘤生长。在机制方面，VGLL4被鉴定为FTO介导m⁶A修饰的靶基因；研究结果揭示，FTO通过改变VGLL4的m⁶A水平驱动TNBC进展，并导致STAT3信号通路激活。总之，这些发现揭示了FTO介导的m⁶A去甲基化在TNBC中的作用，并提示了这种侵袭性疾病的潜在治疗策略。

该研究发表于《Journal of Biological Chemistry》，聚焦三阴性乳腺癌（TNBC）中RNA表观转录组调控机制与肿瘤恶性进展之间的联系。TNBC缺乏雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2）表达，因此无法从内分泌治疗或HER2靶向治疗中获益，临床上表现为较高复发率、较强转移潜能及较差结局。尽管近年来围绕TNBC分子分型与治疗靶点的研究持续推进，但其发病与进展的分子基础仍未完全阐明，这在很大程度上限制了新型治疗策略的开发。N⁶-甲基腺苷（m⁶A）是真核细胞中最常见的转录后RNA修饰之一，由“写入蛋白”“擦除蛋白”“读取蛋白”共同动态调控，参与mRNA剪接、稳定性、翻译及降解等多种过程。既往研究提示m⁶A失衡与多种恶性肿瘤相关，但FTO这一m⁶A去甲基化酶在TNBC中的作用及其下游关键靶标仍不明确，因此有必要开展系统研究。

研究人员围绕FTO在TNBC中的表达特征、生物学功能及分子机制开展研究，得出的核心结论是：FTO在TNBC组织及部分TNBC细胞中高表达，且其高表达与不良临床病理特征和较差预后相关；FTO能够促进TNBC细胞增殖、迁移及体内肿瘤生长；机制上，FTO通过降低VGLL4转录本的m⁶A修饰水平，削弱VGLL4 mRNA稳定性并下调VGLL4表达，进而激活STAT3信号通路并上调PD-L1表达，从而推动TNBC进展。这一发现将FTO、VGLL4、STAT3及免疫检查点相关分子连接为同一功能轴线，为TNBC的分子分层与靶向干预提供了新的理论依据。

本研究的主要技术方法包括：纳入青岛大学附属医院乳腺疾病中心51对TNBC肿瘤及癌旁配对组织，并结合GEO、TCGA、Kaplan-Meier Plotter、cBioPortal和SRAMP数据库进行表达、预后及相关性分析；在MDA-MB-231与BT-549细胞中构建FTO敲低和过表达模型，采用qRT-PCR、WB、IHC、MTT、克隆形成、划痕愈合、Transwell评估分子表达和细胞表型；应用转录组数据分析、MeRIP、RIP及Actinomycin D转录抑制实验解析m⁶A修饰与mRNA稳定性变化；通过裸鼠乳腺脂肪垫原位移植瘤模型验证体内促瘤作用，并以救援实验验证VGLL4/STAT3轴的功能关联。

在结果部分，论文首先以“Characterization of FTO in TNBC tissues”为题，系统描述了FTO在TNBC组织中的表达谱与临床相关性。研究人员基于TISCH数据库的TCGA泛癌分析发现，乳腺癌中FTO的风险比（HR）大于1，提示FTO高表达与死亡和疾病进展风险升高相关。进一步在GSE9014数据集中观察到，FTO在不同分子分型乳腺癌中均较正常乳腺组织升高；在GSE2034中，FTO在伴骨转移的ER阴性乳腺肿瘤中进一步升高。Kaplan-Meier Plotter分析显示，FTO高表达与basal-like亚型较差总体生存相关，而在Luminal A、Luminal B和HER2-enriched亚型中差异不显著。结合51例TNBC临床样本，研究证实FTO在肿瘤组织中显著高表达，并与淋巴结转移、Ki-67指数及TNM分期呈正相关。IHC结果进一步显示，FTO在TNBC组织以及复发或转移组织中的表达均高于癌旁正常组织。这部分结果说明FTO可能是TNBC中与恶性进展及不良预后相关的重要分子标志物。

随后，在“FTO exerted oncogenic role in TNBC cells”中，研究人员通过体外功能实验评估FTO的生物学效应。在MDA-MB-231和BT-549细胞中采用两条特异性siRNA敲低FTO后，MTT和克隆形成实验均显示细胞增殖能力明显下降；Transwell和划痕愈合实验显示细胞迁移能力显著减弱。相对地，在两种细胞中稳定过表达FTO后，增殖及迁移能力均显著增强。该部分结果直接证明FTO在TNBC细胞中具有促肿瘤表型，主要体现在增强增殖与迁移。

在“FTO promotes tumor growth of TNBC in vivo”中，研究人员将FTO过表达或敲低的MDA-MB-231细胞注射至裸鼠第二对乳腺脂肪垫，建立原位移植瘤模型。结果显示，FTO过表达组形成的肿瘤体积更大、重量更高，表明FTO可显著促进TNBC体内肿瘤生长。IHC显示，FTO过表达肿瘤中FTO蛋白水平升高，而VGLL4表达降低。相反，FTO敲低显著抑制移植瘤进展，同时伴随FTO表达下降和VGLL4表达升高。该部分结果从体内层面支持FTO的促瘤作用，并提示VGLL4可能是其关键下游靶点。

在“VGLL4 as a downstream target of FTO-mediated m⁶A modification”中，论文重点解析FTO的分子机制。研究人员从FTO过表达细胞的RNA-seq或m⁶A-seq差异基因中筛选出VGLL4，选择依据包括：VGLL4转录本含有保守m⁶A共识基序、FTO过表达后VGLL4表达显著下降，以及VGLL4已知为TNBC抑癌因子。cBioPortal分析显示FTO与VGLL4蛋白表达呈显著负相关；SRAMP预测VGLL4富含m⁶A位点；GSE129842和GSE130349数据进一步提示，FTO缺失可增加VGLL4的m⁶A修饰，而FTO过表达则降低其m⁶A丰度。实验层面，MeRIP结果显示VGLL4在TNBC细胞中确实存在m⁶A富集；FTO敲低后VGLL4的m⁶A修饰增加，VGLL4 mRNA与蛋白水平均升高，且Actinomycin D实验表明VGLL4 mRNA稳定性增强。相反，FTO过表达降低VGLL4的m⁶A修饰水平、mRNA和蛋白表达，并缩短其mRNA稳定性。由此可见，FTO通过m⁶A依赖方式调控VGLL4转录本稳定性，是其促癌效应的重要分子基础。

接着，在“FTO regulates the VGLL4-STAT3 signaling axis in TNBC cells”中，研究人员将上游RNA修饰事件与经典致癌信号通路联系起来。既往基础表明，VGLL4是TNBC中的抑癌转录辅因子，可通过与STAT3直接相互作用抑制STAT3磷酸化。基于此，研究人员检测FTO变化对VGLL4-STAT3轴的影响。WB结果显示，敲低FTO可升高VGLL4蛋白水平，并同步降低磷酸化STAT3（p-STAT3）与PD-L1表达；而FTO过表达则降低VGLL4并升高p-STAT3和PD-L1。结合TCGA-TNBC相关分析，FTO表达还与CD8⁺ T细胞、CD4⁺ T细胞浸润以及CD274（PD-L1）表达正相关。这部分结果说明，FTO不仅通过抑制VGLL4激活STAT3信号，而且可能与TNBC免疫调控状态有关。

在“Silencing VGLL4 rescued the tumor-suppressive phenotype induced by FTO knockdown in TNBC”中，论文通过救援实验进一步验证因果关系。研究人员在MDA-MB-231和BT-549细胞中共转染FTO siRNA和VGLL4 siRNA，发现沉默VGLL4能够部分逆转FTO敲低导致的增殖抑制和迁移抑制表型；同时，VGLL4 siRNA也减弱了FTO siRNA引起的VGLL4蛋白上调以及p-STAT3下降。该结果表明，FTO的促瘤效应至少部分依赖VGLL4下调及随后的STAT3磷酸化激活，进一步巩固了FTO-VGLL4-STAT3功能轴在TNBC中的关键地位。

讨论部分围绕临床意义、分子机制和研究边界展开。研究人员指出，TNBC临床侵袭性强、缺乏有效靶向治疗，迫切需要新的生物标志物和治疗靶点。结合临床样本、数据库及体内外实验结果，FTO被界定为TNBC中的潜在不良预后标志物和促癌因子。该研究将FTO的致癌作用具体落实到VGLL4这一新的m⁶A靶基因，并进一步连接到STAT3/PD-L1信号轴，提示FTO可能同时影响肿瘤细胞内在恶性表型与免疫相关分子表达。论文同时指出，VGLL4转录本中被FTO直接去甲基化的精确m⁶A位点尚待进一步确认；所用细胞模型主要代表间质相关TNBC亚型，不同分子亚型中该轴线的重要性仍需进一步比较；此外，关于FTO调节免疫治疗敏感性的直接证据仍需在免疫完整模型中验证。这些表述均体现出研究的边界与后续方向，但未超出现有数据支撑范围。

研究结论部分可译为：总之，本研究系统揭示了FTO通过m⁶A介导调控VGLL4-STAT3-PD-L1信号轴，从而驱动TNBC进展的机制。这些发现确立了FTO在TNBC中的致癌作用，并为靶向FTO或该信号通路提供了理论依据和研究基础。