N端两亲性螺旋决定Nramp金属转运蛋白的活性与构象动态

《Journal of Biological Chemistry》：An N-terminal amphipathic helix governs activity and conformational dynamics of Nramp metal transporters

　　

摘要：Nramps是一类质子耦联二价金属离子转运蛋白，在维持必需金属稳态中发挥关键作用。人源Nramp2（DMT1）介导铁摄取以支持细胞及全身铁稳态，而Nramp1将金属从吞噬体排出，参与抗菌防御。对已解析Nramp结构进行的调研显示，紧邻TM1之前的N端螺旋（αA）仅在向外开放（outward-facing）或向外闭塞（outward-facing occluded）状态下折叠，这引出了其在Nramp转运中作用的问题。研究人员结合诱变、转运实验与分子动力学（MD）模拟对αA进行了研究。结果表明，删除αA或替换其中的保守残基会显著降低Fe2+转运能力。模拟显示αA在向外开放状态下表现为两亲性螺旋（amphipathic helix），并优先稳定该构象而非向内开放（inward-facing）构象，从而在控制构象平衡中起关键作用。本研究为Nramps的结构动态提供了新见解，并可能为其他LeuT-fold转运蛋白带来启示。

研究背景：Nramp（自然抗性相关巨噬细胞蛋白）家族是一类质子耦联二价金属离子转运蛋白，广泛存在于生物界，其中人源Nramp2即二价金属转运蛋白1（DMT1，SLC11A2）负责膜上Fe²⁺等二价金属离子的摄取，对细胞及机体铁稳态至关重要；人源Nramp1则主要表达于巨噬细胞，通过将金属排出吞噬体参与天然免疫。已有结构生物学研究显示Nramp家族采用LeuT-fold（LeuT折叠），其核心由10个跨膜螺旋（TM）呈反向重复排列构成，转运循环符合“摇摆束模型（rocking bundle model）”，即TM1/5/6/10相对于其余TM发生显著位移以实现底物结合腔交替暴露于膜两侧。对已解析的Nramp结构进行比对发现，紧邻TM1之前的N端短螺旋αA仅在向外开放（outward-facing，OF）或向外闭塞（outward-facing occluded，OOC）状态下折叠且结构明确，而在所有向内开放（inward-facing，IF）状态结构中均呈无序或未解析状态，这种构象依赖性暗示αA可能在转运循环中具动态功能，但其确切作用尚未阐明。鉴于Nramp dysfunction与低色素小细胞性贫血、遗传性血色素沉着症、神经退行性疾病等相关，明确其结构动态调控机制具有重要意义。该研究发表于《Journal of Biological Chemistry》。

主要技术方法：研究人员采用大鼠DMT1（rDMT1，与人对位物91.7%相同）为模型，构建细胞表面FLAG标记（插入TM11?TM12胞外环）的稳定表达系统；建立基于⁵⁷Fe同位素与ICP?MS定量检测铁转运活性的细胞实验体系；开展αA区截短（Δ61、Δ74）及残基丙氨酸扫描诱变，结合流式细胞术与非透化/透化免疫荧光定量细胞表面及总蛋白表达以校正转运活性；选用人Nramp1（hNramp1）为模拟对象，利用AlphaFold?Cluster法预测OF状态模型（以原核Eremococcus coleocola Nramp OF结构PDB:5M87及人Nramp1 OOC结构PDB:9F6Q为模板），以实验解析的IF（PDB:9F6P）、OOC（PDB:9F6Q）结构为基础，在POPC膜体系中开展全原子分子动力学（MD）模拟（ff19SB/lipid21力场，AMBER22），设计野生型、αA缺失（Δ62对应rDMT1 Δ74）、αA?TM7互作突变（F53A/F61A/Y283A）及IF态添加预测αA（部分折叠或突变）等六类体系，各独立重复三次、生产运行每体系2 μs；通过RMSF、残基间距、US?align的TM?score等分析构象动态与结构相似度变化。

研究结果：

αA是DMT1转运活性所必需的：研究人员通过⁵⁷Fe转运实验发现，删除αA前期非结构化61残基（Δ61）使活性降低约75%，而删除包含αA在内的N端74残基（Δ74）完全消除Fe²⁺转运能力；流式与免疫荧光显示Δ74细胞表面表达仅降低约50%，表明αA缺失主要损害转运功能而非 trafficking。丙氨酸扫描覆盖αA残基65?73（按rDMT1编号F65至F73），所有突变体活性显著下降（R68A损失近90%），其中仅R68A、L69A有适度细胞表面表达降低，说明活性丧失源于转运效率下降而非表达缺陷。结构分析表明αA残基参与三类互作：F65/K69/L70/F73与TM7作用，F67/R68/W71面向膜脂界面，S66为螺旋帽稳定αA本身；突变对应TM7上互作残基Y295A也使活性降80%，提示αA?TM7互作为功能核心，且该模式在原核与后生动物Nramp中保守。

αA在hNramp1的OF态中是稳定的两亲性螺旋：研究人员在OF预测模型与IF实验结构（补全αA）中进行MD模拟。OF态下αA呈稳定两亲性螺旋：疏水侧（F53、L55、L58等）插入脂双层非极性区，亲水/带电残基（R56、K57、W59等）定位于脂?水界面并与膜脂互作；F53、K57、L58、F61与TM7的Y283等形成稳定αA?TM7接触。若引入F53A/F61A/Y283A三重突变，αA螺旋虽能维持但αA?TM7互作严重破坏。IF态下（初始添加部分折叠αA）模拟显示TM1a上摆迫使αA更深埋入脂双层且倾斜更大，αA?TM7接触大幅减少，αA的RMSF显著高于OF态，解释了实验中IF结构无法解析αA的原因。

αA优先稳定OF构象：研究人员比较OF与IF态下野生型、Δ62（αA缺失）、F53A/F61A/Y283A的MD结果。OF态中删除αA或破坏αA?TM7互作均使整体RMSF上升（尤TM4/5、TM9?12区），且OF起始的模拟结构相似度（相对IF结构TM?score）从野生型70?75%提升至Δ62的75?80%、三重突变次之，结构快照显示Δ62在OF背景下发生偏向IF的TM位移（TM1/4/5/6/10），说明αA稳定OF构象；而IF态下无论有无αA或突变，RMSF与结构相似度（相对OF）均无明显变化，仅添加αA时TM5有轻微位移，表明αA对IF态影响很小。综上αA作为两亲性螺旋通过αA?TM7及αA?脂膜互作锚定TM1a于“下”位（OF/OOC），优先稳定OF构象并偏向底物摄取兼容状态。

讨论部分总结：TM1动态特别是TM1a在Nramp构象转换中关键，OF态TM1a“下”位封闭胞质侧并伴随αA折叠，IF态TM1a“上”位开放胞质侧且αA无序。研究人员通过实验与MD综合表明αA对转运活性必不可少，其作为两亲性螺旋在OF/OOC稳定结合TM7与膜脂，稳定TM1a下位并偏向OF构象；底物结合触发OF→IF转换时TM1a上摆破坏αA?TM7互作并致αA解折叠，金属释放后IF→OF回摆重建αA?TM7?脂互作而再稳定OF。该模型为Nramp循环提供新机制视角。与其他LeuT?fold转运蛋白（如LeuT的pre?TM1残基W8、SERT的T81）不同，Nramp采用两亲性螺旋（αA）与TM7及膜互作调控构象平衡，是此前未识别的LeuT?fold功能调控模式；两亲性螺旋行为对膜脂环境敏感，αA序列跨生命界差异可能适应各自膜脂组成；该发现不仅深化Nramp机制理解，也为其他LeuT?fold转运蛋白的结构动态研究提供新范式。