DNA双链的甲基化通过凝聚体形成调控cGAS介导的先天免疫激活

《RSC Chemical Biology》：Methylation of DNA duplexes regulates cGAS-mediated innate immune activation via condensate formation

　　

外源性DNA通过cGAS–STING通路激活先天免疫，但化学修饰的影响尚未得到充分研究。研究人员证明，含有2′-O-甲基核糖核苷酸的DNA双链可增强cGAS驱动的液-液相分离（LLPS）和酶活性，在活细胞中的DNA纳米治疗中发挥有效作用，并使先天免疫信号传导的理性调控成为可能。

该研究发表于《RSC Chemical Biology》，围绕DNA双链化学修饰如何影响环状GMP–AMP合成酶（cGAS，细胞质DNA感受器）介导的先天免疫激活展开。先天免疫是宿主抵御病原体入侵的第一道防线，其中模式识别受体（PRRs）负责识别病原相关分子模式并启动炎症信号通路。cGAS–STING通路是识别胞质双链DNA（dsDNA）并诱导I型干扰素应答的核心机制之一。既往研究已较清楚地说明，dsDNA长度是影响cGAS活化的重要因素：较长的DNA更有利于cGAS二聚化，并通过液-液相分离（LLPS）形成富集反应组分的凝聚体，从而增强cGAMP生成。然而，除长度之外，DNA本身的化学性质，尤其是核碱基、糖环和磷酸二酯骨架修饰，对cGAS识别与激活的影响仍缺乏系统研究。与此同时，核酸药物开发高度依赖化学修饰，因为此类修饰可改善稳定性、药代性质和靶标结合特征。因此，阐明DNA化学修饰对cGAS–STING通路的调控规律，不仅有助于深化对先天免疫识别机制的理解，也有助于推动免疫治疗药物和疫苗佐剂的理性设计。

研究人员据此选取三类具有代表性的甲基化相关修饰进行比较：作为核碱基修饰的5-甲基胞嘧啶（5mC）、作为糖环修饰的2′-O-甲基RNA（2′-OMe）以及作为磷酸二酯骨架修饰的甲基膦酸酯（MP）。研究假设认为，dsDNA结构和电荷状态的改变，可能影响其与cGAS的结合能力以及形成相分离凝聚体的倾向，进而调控cGAS活性。基于这一思路，研究人员构建了长度为68 bp的双链DNA模型，在每条链的5个胞嘧啶位点引入相应修饰，以保证DNA长度超过已知的cGAS激活阈值并比较不同修饰的效应。研究结果表明，三类修饰对cGAS活化具有明显不同的影响，其中2′-OMe修饰最为突出：该修饰显著增强cGAS介导的cGAMP生成、促进更大的凝聚体形成、增强细胞内报告信号和细胞毒性，并在转录组层面诱导更强的抗病毒和炎症相关程序。相较之下，MP修饰削弱cGAS结合并几乎抑制cGAMP产生，但仍保留一定细胞毒性，提示其可能涉及cGAS非依赖性机制。5mC修饰则整体表现为活化能力下降或接近未修饰DNA。研究的重要意义在于提出了一个统一的机制框架：DNA双链的化学修饰可通过改变双链的理化性质、构象偏好和多价相互作用能力，差异性调控cGAS介导的先天免疫激活，其中2′-OMe修饰尤其有望用于提升免疫型抗肿瘤药物和疫苗佐剂的设计效率。

在方法学方面，研究主要采用了以下关键技术。首先，研究人员合成含不同化学修饰的68-mer单链DNA并退火形成双链，随后利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（native PAGE）验证双链形成。其次，通过熔解温度（T_m）测定和圆二色谱（CD）分析评估修饰对DNA热稳定性和螺旋构象的影响。再次，采用凝胶迁移实验检测dsDNA与cGAS的结合能力，并通过高效液相色谱（HPLC）与酶联免疫吸附测定（ELISA）定量cGAMP生成。进一步地，研究在THP1-Lucia ISG细胞中利用荧光素酶报告系统检测细胞内cGAS–STING信号活化，在HeLa细胞中评估细胞毒性及半数抑制浓度（IC₅₀）。最后，借助共聚焦显微镜观察凝聚体形成，并通过荧光漂白后恢复（FRAP）评估凝聚体流动性；补充性RNA测序（RNA-seq）用于分析转录组应答。样本来源主要为体外构建的化学合成DNA双链以及培养细胞系THP1-Lucia ISG和HeLa细胞。

在研究结果部分，论文首先通过“Effects of chemical modifications on DNA duplex stability and structure”说明不同修饰并不妨碍68 bp DNA双链形成。native PAGE显示，无论引入5mC、2′-OMe还是MP修饰，DNA-1与DNA-2均可成功退火形成双链。T_m分析进一步表明，未修饰双链的T_m为76 °C，5mC修饰升高至77 °C，而2′-OMe和MP分别降至71 °C与72 °C，但都高于生理温度，说明这些双链在37 °C下具有足够稳定性。CD结果显示，2′-OMe修饰使正峰由约280 nm向短波方向偏移，提示双链构象向A型（A-form）特征部分转变；MP修饰则表现出较弱的280 nm附近正峰，提示其双链结构可能更具动态性或柔性。该部分结论是，化学修饰不仅影响双链稳定性，还可改变DNA的构象特征，这为后续cGAS识别差异提供了结构基础。

随后，“Effects of chemical modifications on cGAS activation by DNA duplexes”部分重点分析修饰对cGAS结合与活化的影响。凝胶迁移实验显示，随着cGAS浓度升高，各组双链与cGAS结合增加，但MP修饰双链的结合明显弱于未修饰DNA，而5mC和2′-OMe与未修饰组大体相近。这一结果支持这样一种解释：cGAS主要通过其带正电荷的沟槽与DNA磷酸骨架发生静电相互作用，MP修饰将带负电的氧原子替换为中性的甲基，因而削弱了这种相互作用。功能层面，HPLC和ELISA均表明2′-OMe修饰显著提高cGAMP生成，5mC修饰降低cGAMP产量，而MP修饰几乎不产生可检测的cGAMP。在THP1-Lucia ISG细胞中，2′-OMe修饰双链引发更强的荧光素酶报告活性，说明其在活细胞内也更有效地激活cGAS–STING通路；MP修饰则难以充分激活该通路。该部分得出的核心结论是，糖环2′-OMe修饰能够增强cGAS功能输出，而骨架MP修饰则显著抑制cGAS介导的先天免疫激活。

在“Effects of chemical modifications on LLPS of dsDNA duplexes with cGAS”部分，研究人员将cGAS激活差异与凝聚体形成联系起来。共聚焦成像显示，2′-OMe修饰双链在与cGAS混合后早期凝聚体形成较慢，但在60 min后形成更大的凝聚体；未修饰双链也可形成凝聚体，但规模较小；MP修饰双链在60 min后仍几乎看不到明显凝聚体。对凝聚体尺寸的量化结果与cGAMP生成和细胞实验结果相一致，提示cGAS–dsDNA复合物的LLPS行为与cGAS活性密切相关。FRAP实验进一步表明，无论是未修饰双链还是2′-OMe修饰双链，随着与cGAS混合后的孵育时间延长，荧光恢复均逐渐减慢，说明凝聚体从早期较高流动性的液态状态逐步向低流动性的凝胶样状态成熟。论文据此指出，2′-OMe修饰增强cGAS活性的重要基础在于促进更有效的多价相互作用和凝聚体形成，从而建立更有利于酶促反应的微环境。

在“Cytotoxicity of chemically modified dsDNA”部分，研究人员进一步考察不同修饰的生物学效应。HeLa细胞实验显示，与未修饰双链相比，5mC修饰降低细胞毒性，而2′-OMe修饰增强细胞毒性；这一趋势与先前观察到的cGAS活化强度相一致，支持其细胞毒性主要经由cGAS–STING通路介导。MP修饰双链虽然不能有效激活cGAS，但细胞毒性与未修饰组相近，提示存在其他致毒机制。论文结合MP修饰中性化磷酸骨架负电荷、降低分子极性的特点，指出其可能更易与细胞内蛋白发生非特异性相互作用；此外，既往研究显示MP修饰寡核苷酸的细胞摄取途径不同于普通磷酸二酯寡核苷酸，这也可能参与其cGAS非依赖性毒性。

在后续综合分析中，论文指出，在所比较的几种DNA甲基化修饰中，2′-OMe是最有前景的先天免疫增强策略。RNA测序结果进一步显示，未修饰双链和2′-OMe修饰双链均可诱导广泛的先天免疫和炎症性转录程序，包括RIG-I样受体、NOD样受体、TNF、IL-17和NF-κB信号通路的富集；其中2′-OMe修饰组在多条病毒感染相关KEGG通路中富集更强，提示其抗病毒先天免疫转录特征更突出。这些转录组变化与其更强的cGAS活化、凝聚体形成及细胞毒性相互印证。尽管2′-OMe为何能增强凝聚体形成及酶活性的精确结构基础尚未完全阐明，研究人员认为其可能与双链构象、局部水合和动态性质的细微改变有关。

讨论部分的核心在于提出统一机制模型：DNA双链的化学修饰可通过改变理化性质调控cGAS活化的结构基础和功能输出。具体而言，2′-OMe修饰可能通过增强cGAS–DNA多价相互作用和促进凝聚体形成，提高LLPS效率，继而增强cGAS酶活性、放大先天免疫转录反应并提高细胞毒性；MP修饰则因削弱骨架负电荷导致cGAS结合和激活受抑，但其细胞毒性提示还存在独立于cGAS的作用通路。研究同时强调，受限于化学合成难度，本研究所采用的修饰位点数量和分布有限，因此相关结论仍需在其他DNA序列和修饰模式中进一步验证。总体上，这项工作证明了DNA双链化学修饰并非仅影响核酸稳定性或递送性能，还能深刻塑造cGAS介导的免疫识别与信号转导景观。

研究结论部分可译为：双链DNA（dsDNA）的糖环、核碱基和磷酸二酯键修饰能够调节cGAS–STING通路活性，其中2′-OMe修饰DNA表现出增强的cGAMP生成和细胞毒性。研究进一步证明，2′-OMe修饰DNA的强激活特性依赖于凝聚体的高效形成，而凝聚体在建立DNA与cGAS之间的反应环境中发挥关键作用。本研究强调，应对化学修饰dsDNA双链进行理性设计，以推动免疫型抗癌药物和疫苗佐剂的开发。