黄精(Polygonati Rhizoma)减轻牙周膜干细胞(Periodontal Ligament Stem Cells, PDLSCs)氧化应激诱导的细胞衰老

《Food Science & Nutrition》：Polygonati Rhizoma Attenuates Oxidative Stress-Induced Senescence in Periodontal Ligament Stem Cells

　　

摘要：牙周炎(Periodontitis)日益被认为是一种非传染性慢性口腔疾病，其中持续性氧化应激(Oxidative Stress)和细胞衰老(Cellular Senescence)驱动低度炎症和组织破坏。黄精(Polygonati Rhizoma, PR)是广泛作为功能性食品原料使用的传统中药，富含抗氧化多酚和多糖，但其调控牙周膜干细胞(PDLSCs)衰老的作用尚不清楚。本研究整合网络药理学(Network Pharmacology)与实验验证阐明PR对抗氧化应激诱导PDLSCs衰老的保护效应及机制。收集PR潜在成分及牙周炎和衰老相关靶点构建蛋白互作(Protein-Protein Interaction, PPI)网络，预测出21个核心靶点，包括TP53、RELA(p65)、TNF-α、TGF-β1、IL-6、IL-1β、CXCL8和MMP-9等关键炎症与衰老相关蛋白。基因本体(Gene Ontology, GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)富集分析突出细胞衰老、NF-κB信号通路和氧化应激反应相关通路。分子对接(Molecular Docking)提示PR主要成分与推定核心蛋白靶标有强结合亲和力。在体外氧化应激诱导PDLSCs衰老模型中，以二甲双胍(Metformin)为阳性对照，PR含药血清显著降低细胞内氧化应激标志物、缓解细胞周期阻滞并下调衰老相关分泌表型(Senescence-Associated Secretory Phenotype, SASP)细胞因子。PR显示出与二甲双胍可比的抗衰老效能且具独特分子特征。结果表明PR通过多成分、多靶点调控PDLSCs中以NF-κB为中心的炎症与衰老通路，从而减轻氧化应激诱导的细胞老化。作为一种可食用功能性草药，PR可能成为预防和管理细胞衰老相关牙周炎的潜在膳食辅助手段。

研究背景：牙周炎是导致成人牙齿丧失的首要原因，其特征为慢性感染导致上皮附着丧失和牙槽骨进行性吸收，全球患病率为20%~50%。常规治疗以控制菌斑和减轻炎症为主，难以完全修复受损牙周组织。牙周膜干细胞(PDLSCs)因其成骨、成牙骨质分化潜能被认为是牙周组织再生理想的种子细胞，但在牙周炎微环境中，细菌入侵引发的中性粒细胞呼吸爆发产生大量活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)，诱导氧化应激，加速PDLSCs发生细胞衰老并分泌衰老相关分泌表型(SASP)因子(如IL-6、IL-1β、TNF-α、MMP-9等)，放大局部炎症、抑制干细胞自我更新与免疫调节功能，阻碍组织愈合。黄精(Polygonati Rhizoma, PR)含有多糖、黄酮、皂苷等活性成分，具抗氧化、抗炎及抗衰老作用，但其是否可减轻氧化应激诱导的PDLSCs衰老及具体分子机制尚未明确。研究人员通过联合网络药理学预测与体外细胞实验验证，探究PR活性成分对氧化应激诱导PDLSCs衰老的干预作用及NF-κB信号通路相关机制，以明确PR作为膳食辅助治疗牙周炎及相关细胞衰老的潜力。该论文发表于《Food Science & Nutrition》。

主要关键技术方法：研究人员采用网络药理学方法——从TCMSP、ETCM等数据库获取PR活性成分及靶点，从GeneCards、GenAge等数据库获取牙周炎与衰老交集靶点，取交集后构建STRING PPI网络并用Cytoscape插件cytoHubba和MCODE筛选核心靶点与聚类，进行GO和KEGG富集分析，并用AutoDock Vina进行PR活性成分与核心靶点的分子对接验证；采用含药血清药理学方法——对SD大鼠灌胃高剂量PR(20 g/kg)7 d后腹主动脉采血制备PR含药血清，并以空白血清为对照；建立D-半乳糖(D-Gal, 10 g/L)诱导PDLSCs氧化应激衰老模型，设对照组、D-Gal模型组、PR含药血清+D-Gal干预组、二甲双胍(Met, 100 μM)+D-Gal阳性对照组；通过CCK-8检测细胞活力，DCFH-DA探针检测细胞内ROS水平，SA-β-Gal染色评估细胞衰老比例，流式细胞术检测细胞周期分布，ELISA检测上清SASP因子(TNF-α、IL-6、IL-1β、TGF-_β1、MMP-9、CXCL-8)分泌水平，Western Blot检测衰老标志物p16^INK4a、p21^CIP1/WAF1、p53及NF-κB通路关键蛋白p65、磷酸化p65(p-p65)的表达。

研究结果：

3.1 网络药理学分析结果：从数据库筛选出PR 20个潜在活性成分(如β-谷甾醇、黄芩素、山奈酚、杨梅素、薯蓣皂苷元等)对应329个靶点，与牙周炎(2459个)及衰老(2561个)靶点取交集获90个候选治疗靶点，PPI网络分析确定42个关键靶点，其中最高评分簇含21个核心靶点为TP53、RELA(NF-κB p65)、TNF、IL6、IL1B、TGFB1、MMP9、CXCL8、AKT1、JUN、FOS、BCL2、HIF1A、MAPK14、NFKBIA、PTGS2、STAT3、MAPK1、EGFR、MAPK8。GO富集主要涉及miRNA代谢调控、转录调控及泛素蛋白连接酶活性等；KEGG富集显著富集于细胞衰老(hsa04218)、NF-κB信号通路(hsa04064)、TNF信号通路(hsa04668)、PI3K-Akt信号通路(hsa04151)等。分子对接显示PR活性成分与核心靶点结合能范围为-5.5至-9.7 kcal/mol，其中黄芩素与MMP-9结合能最低(-9.7 kcal/mol)，表明PR成分与核心靶点具良好结合亲和力。

3.2 验证实验结果：PDLSCs经组织块法分离培养，呈梭形旋涡状生长，符合间充质干细胞形态。CCK-8显示10 g/L D-Gal处理48 h可显著降低PDLSCs活力并显著提升SA-β-Gal阳性率(p<0.001)，成功建立氧化应激诱导衰老模型。HPLC确认PR含药血清中含杨梅素、山奈酚、黄芩素、β-谷甾醇、薯蓣皂苷元等入血成分。5% PR含药血清对PDLSCs无明显毒性，选为干预浓度。ROS检测显示D-Gal组荧光强度显著高于对照组(p<0.001)，PR含药血清+D-Gal组与Met+D-Gal组ROS水平均显著低于D-Gal组(p<0.01)，两组间无显著差异。SA-β-Gal染色显示D-Gal组衰老率显著升高(p<0.001)，PR含药血清与二甲双胍干预均显著降低衰老率(p<0.05)，组间无显著差异。细胞周期分析显示D-Gal组G₀/G₁期细胞比例显著升高(p<0.01)，两干预组G₀/G₁期比例均显著回降(p<0.001)。ELISA显示D-Gal组SASP因子(TNF-α、IL-6、IL-1β、TGF-_β1、MMP-9、CXCL-8)分泌显著上调(p<0.001或p<0.01)，PR含药血清与二甲双胍均显著下调其分泌(p<0.05)，其中Met对MMP-9的下调强于PR含药血清(p<0.05)。Western Blot显示D-Gal组p16、p21、p53及p-p65/p65比值显著升高(p<0.001)，PR含药血清与二甲双胍干预均显著下调这些蛋白表达(p<0.05或p<0.01)，两组间无显著差异。

讨论部分总结：研究人员指出D-Gal通过产生活性氧及晚期糖基化终产物激活NF-κB通路并诱导SASP分泌，成功建立PDLSCs衰老模型；含药血清法可反映PR经消化道吸收后的生物转化效应，HPLC证实PR黄酮类及皂苷类成分可入血。网络药理学预测PR通过多成分(黄芩素、薯蓣皂苷元、山奈酚等)作用于多靶点(TP53、RELA、TNF-α等)调控NF-κB为中心的炎症与衰老通路，实验验证了PR含药血清可降低ROS、减轻细胞周期G₀/G₁期阻滞、下调p16/p21/p53及p-NF-κB表达、抑制SASP分泌，抗衰老效果与二甲双胍相当，但二甲双胍对部分SASP因子(MMP-9)抑制略强。研究局限性包括网络药理学数据库可能存在信息偏差、分子对接未考虑蛋白柔性、体外模型未能完全模拟体内微环境，后续需在动物模型进一步验证。PR有望开发为牙周基础治疗后的局部缓释凝胶、含漱液或黏膜贴片，作为宿主调节辅助疗法。

结论(翻译)：黄精(PR)通过本研究网络药理学工作流预测并经实验验证的多成分、多靶点调控作用，减轻氧化应激诱导的牙周膜干细胞(PDLSCs)衰老。PR含药血清降低氧化损伤，经由NF-κB通路抑制衰老相关分泌表型(SASP)，且在多数检测指标中表现出与二甲双胍可比的效价，尽管二甲双胍对SASP蛋白的下调稍强。这些发现将PR定位为延缓PDLSCs衰老及推进牙周组织工程策略的有前景的辅助疗法，同时网络药理学预测也为牙周炎抗衰老干预提供了新的推定方向。