编辑推荐：
线粒体铁动态变化对于细胞呼吸和代谢稳态至关重要，然而调控线粒体铁供应的分子机制仍知之甚少。本研究鉴定了一条以血红素（haem）作为线粒体铁来源的通路，该通路维持线粒体铁稳态和线粒体超复合体（supercomplex）的完整性，并在线粒体-内质网接触位点（MER
线粒体铁动态变化对于细胞呼吸和代谢稳态至关重要，然而调控线粒体铁供应的分子机制仍知之甚少。本研究鉴定了一条以血红素（haem）作为线粒体铁来源的通路，该通路维持线粒体铁稳态和线粒体超复合体（supercomplex）的完整性，并在线粒体-内质网接触位点（MERCs）处受到调控。研究人员证实，内质网（ER）驻留酶血红素氧合酶2（HMOX2）同样定位于MERCs，并促进血红素衍生铁向线粒体的供应。该过程由线粒体泛素连接酶MITOL（亦称MARCH5/MARCHF5）调控，MITOL以K63连接的多聚泛素链对HMOX2的K68位点进行泛素化修饰，从而增强其血红素降解活性。值得注意的是，HMOX2的缺失或MITOL介导的泛素化被破坏均会损害线粒体铁稳态和线粒体呼吸。这些发现确立了MERCs作为铁供应枢纽的功能范式，将血红素代谢与线粒体铁利用整合在一起。
线粒体-内质网接触位点（MERCs）是介导线粒体与内质网（ER）之间通讯的特化细胞器间接触区域，距离约为10-30 nm，在维持代谢稳态以及多种生理和病理过程中发挥关键调控作用。MERCs作为线粒体与ER之间必需代谢物（包括脂质和钙离子）交换的枢纽，其中从ER向线粒体的钙转运对于维持三羧酸（TCA）循环和氧化磷酸化（OXPHOS）相关线粒体基质酶的活性至关重要。MERCs的形成和功能受到氧化应激和营养可利用性等线粒体条件的动态调控。鉴于MERCs对线粒体功能的深远影响，其可能还存在其他尚未阐明的调控机制。
线粒体泛素连接酶MITOL（亦称MARCH5/MARCHF5）是线粒体外膜蛋白，通过泛素化线粒体分裂因子和错误折叠蛋白来调控线粒体动态和质量控制。此外，MITOL定位于线粒体相关ER膜（MAM）组分，在维持MERCs完整性方面发挥关键作用。已有多种MERCs蛋白（包括MFN2、IRE1α和RMDN3）被鉴定为MITOL的底物，表明MITOL通过泛素化促进MERCs的形成和功能。近期基于APEX2-MITOL的邻近标记分析鉴定了大量MERCs相关蛋白，证明MITOL介导的综合分析策略可有效用于发现MERCs调控因子。
铁稳态通过多种调控系统严格调控细胞的铁摄取、外排和储存。功能性铁主要以血红素和铁-硫（Fe-S）簇的形式被利用，二者均在线粒体中生物合成。线粒体是富含铁的细胞器，也是Fe-S簇合成和血红素合成的中心场所，这两种含铁辅因子作为电子载体在TCA循环和OXPHOS中不可或缺。线粒体铁平衡的破坏——无论是铁过载还是铁缺乏——以及Fe-S簇生物合成的缺陷均与多种人类疾病相关。因此，需要精密的调控机制以确保向线粒体高效供应铁以维持细胞稳态。
早期内体与线粒体短暂相互作用以直接转运铁的"吻别-运行"（kiss-and-run）机制已被提出作为线粒体铁获取途径。然而，参与感知和响应线粒体铁需求的线粒体蛋白仍有待鉴定。此外，铁限制条件下的替代铁利用途径正在研究中，血红素衍生铁的潜在作用已被提出。
血红素氧合酶（HMOX）包括两种功能性同工酶HMOX1和HMOX2，是哺乳动物中唯一能直接催化细胞内血红素降解的酶。血红素被HMOX代谢为胆绿素、铁和一氧化碳（CO），这是产生血红素衍生铁的唯一细胞途径。HMOX1作为应激诱导的抗氧化酶已广为人知，但HMOX2的生理作用尚不完全清楚。
本研究证明了HMOX2作为调节血红素衍生铁供应至线粒体的调控因子，而MITOL在MERCs处通过泛素化控制这一过程。研究结果建立了MERCs、血红素代谢与线粒体铁利用之间的机制联系，揭示了一条此前未被认识的线粒体铁供应途径。
在结果部分，研究人员首先通过TurboID邻近生物素标记分析鉴定HMOX2为MITOL的邻近蛋白，并通过免疫共沉淀证实HMOX2与MITOL的相互作用。亚细胞分级分离显示HMOX2不仅定位于ER，还富集于MAM组分。HMOX2的跨膜结构域缺失突变体无法定位于ER且不能与MITOL相互作用，表明HMOX2的ER膜定位对其与MITOL的相互作用至关重要。
研究人员进一步证实MITOL特异性介导HMOX2而非HMOX1的K63连接多聚泛素化修饰，泛素化位点为HMOX2的K68位点。通过UbiCRest泛素链限制性分析确认MITOL添加的是K63连接而非K48、K6或K11连接的泛素链。环己酰亚胺追踪和MG132处理实验表明MITOL不影响HMOX2蛋白稳定性，而是调控其功能活性。敲低MERCs锚定蛋白PDZD8或VAPB会削弱MITOL介导的HMOX2泛素化，证明完整的MERCs结构对于该泛素化过程是必需的。
为定量检测HMOX2的酶活性，研究人员构建了基于IFP2.0荧光蛋白和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的双顺反子报告系统，IFP2.0作为胆绿素水平的报告分子反映HMOX活性。在HMOX1和HMOX2双敲除（DKO）细胞中，野生型HMOX2的表达显著恢复IFP2.0荧光信号，而失去血红素降解活性的HMOX2 HW/GW突变体、不能结合血红素的C265A突变体以及不能泛素化的K68R突变体均显示降低的酶活性。共表达MITOL可增强野生型HMOX2的活性但不能增强K68R突变体的活性，表明MITOL介导的K68位点泛素化有助于增强HMOX2的血红素降解活性。
在探究MITOL-HMOX2轴的生理功能时，研究人员发现铁螯合剂去铁胺（DFO）诱导的铁缺乏或敲低线粒体内膜铁转运体mitoferrin-1（MFRN1）均可增强MITOL介导的HMOX2泛素化。通过电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）定量分析，HMOX2敲除和DKO细胞的线粒体铁浓度显著低于野生型和HMOX1敲除细胞，而其他金属离子（Mn、Cu、Zn）无显著差异。外源性血红素或柠檬酸铁铵（FAC）处理不能完全恢复HMOX2敲除细胞的线粒体铁水平。在HMOX2敲除细胞中重新表达野生型HMOX2可恢复线粒体铁水平，但HW/GW突变体或K68R突变体均不能恢复，表明HMOX2的血红素降解活性和MITOL介导的泛素化对维持线粒体铁水平至关重要。值得注意的是，ER和细胞质组分的铁水平未受影响，说明该调控具有线粒体特异性。敲除PDZD8或VAPB也导致线粒体铁水平降低，而过表达人工MERCs连接子可部分挽救这一表型，进一步证实MERCs形成对线粒体铁稳态的必要性。
在呼吸功能方面，HMOX2敲除和DKO细胞的基础呼吸和最大呼吸能力显著降低，而HMOX1敲除细胞无显著变化。HMOX2敲除细胞中Fe-S簇蛋白SDHB和Rieske的表达水平下降，这一表型可通过重新表达野生型HMOX2恢复，但HW/GW或K68R突变体无法恢复。使用血红素缺乏（HD）培养基的实验进一步证明，即使非血红素铁充足，血红素缺乏仍导致SDHB和Rieske去稳定化及线粒体呼吸下降；补充血红素可恢复但补充FAC或holo-转铁蛋白（holo-Tf）不能恢复。在WT和HMOX1敲除细胞中补充血红素可恢复SDHB和Rieske，但在DKO和HMOX2敲除细胞中不能恢复，确立了HMOX2介导的血红素衍生铁对于线粒体铁稳态和呼吸复合物稳定性的核心作用。
在C2C12细胞（具有更高线粒体依赖性）中的验证实验显示，HMOX2敲除导致线粒体铁水平下降，重新表达野生型HMOX2可恢复但K68R突变体不能恢复。清晰天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（CN-PAGE）和凝胶内活性分析表明，HMOX2敲除和K68R突变体细胞中高分子量的线粒体呼吸超复合体（SC）活性降低，呼吸复合物形成受损。细胞增殖实验也显示HMOX2敲除细胞增殖减缓，依赖于线粒体功能的恢复。MITOL敲除同样导致C2C12细胞线粒体铁水平下降，野生型MITOL可恢复而E3活性缺陷的CS突变体不能恢复。
在讨论部分，研究人员指出HMOX1主要调控细胞内血红素水平和抗氧化反应，其产生的铁主要储存于铁蛋白中；而HMOX2特异性维持线粒体总铁水平，不影响ER或细胞质铁水平。HMOX2对于Rieske和SDHB的稳定性以及超复合体形成至关重要。由于超复合体形成对于OXPHOS中的高效电子转运具有重要作用，HMOX2可能通过调控超复合体来增强线粒体能量产生。MERCs此前被认为参与钙和脂质转运，本研究揭示了其在铁供应中的新功能，表明MERCs作为铁稳态调控枢纽，通过近距离调控确保铁向线粒体的高效递送，并由线粒体外膜蛋白MITOL响应线粒体铁需求进行调控。
研究结论指出，MITOL介导的HMOX2 K68位点K63连接多聚泛素化在维持线粒体铁稳态中发挥关键作用。与转录调控的HMOX1不同，HMOX2在翻译后水平受到调控，MITOL介导的泛素化作为响应线粒体铁需求的调控开关来调节HMOX2酶活性。HMOX2 C末端含有的血红素调控基序（HRMs）可能通过氧化还原依赖的构象变化影响血红素结合和酶活性，而泛素化可能增强HMOX2的结构柔性以促进血红素从HRM向催化位点的转移。该研究确立了血红素作为线粒体铁利用的关键来源，支持Rieske和SDHB的稳定性及线粒体呼吸功能。未来研究需阐明MERCs到线粒体的铁转运分子机制，以及MITOL-HMOX2通路对线粒体铁需求的具体贡献，同时探索该通路失调在神经退行性疾病、线粒体疾病和癌症等中的作用，以期为疾病干预和治疗开发提供新见解。
