利用伊文思蓝染料评估iRGD(internalizing RGD)介导的肿瘤内药物蓄积

《Cancer Research Communications》：Assessment of iRGD-mediated drug accumulation in tumors using Evans blue dy... Open Access

　　

免疫检查点抑制剂(ICI)在部分结直肠癌中可产生持久疗效，但其获益主要局限于微卫星高度不稳定(MSI-H)肿瘤。研究人员探讨了肿瘤穿透肽iRGD(internalizing RGD)是否能增强抗程序性死亡蛋白1(anti-PD-1)治疗疗效，并分析了神经纤毛蛋白1(NRP1)表达的临床相关性。使用同源小鼠模型（MSI-H MC38与微卫星稳定CT26）给予anti-PD-1抗体联合iRGD治疗；通过比较NRP1敲除结直肠癌细胞系来解析肿瘤细胞与基质NRP1各自的贡献；采用免疫组化(IHC)分析110例接受根治性手术的Ⅲ期结直肠癌连续队列中NRP1的表达。结果显示，iRGD与anti-PD-1抗体联合治疗增强了两种结直肠癌模型的抗肿瘤效应，伴随瘤内CD8+T细胞数量增加及其功能改善。该效应在缺失肿瘤细胞NRP1的肿瘤中依然存续，提示基质NRP1在介导iRGD活性中起关键作用。人类结直肠癌标本中NRP1广泛表达于肿瘤细胞、基质区室及脉管系统，表明iRGD为基础的治疗在人类结直肠癌中具有潜在适用性。值得注意的是，基质NRP1表达尤其在内皮细胞中与较差的总生存和无病生存相关。综上，这些发现将基质NRP1定位为预后标志物以及iRGD为基础的ICI策略的可操作切入点，为将其临床开发以扩大ICI获益人群至更广泛的结直肠癌群体提供了有力依据。意义：研究人员证实iRGD可增强anti-PD-1疗法在结直肠癌模型中的疗效，改善瘤内通透性与抗肿瘤免疫应答；NRP1广泛表达于各肿瘤区室，基质特别是内皮NRP1是iRGD活性的关键介质且预后不良，代表潜在治疗切入点。

研究背景：结直肠癌是全球癌症相关死亡的主要原因之一，尽管系统性治疗不断进步，不可切除或转移性疾病患者预后仍较差。免疫检查点抑制剂(ICI)尤其是抗程序性死亡蛋白1(anti-PD-1)与抗程序性死亡配体1(anti-PD-L1)抗体在部分癌种中实现长期生存获益，但在结直肠癌中其临床获益主要局限于微卫星高度不稳定(MSI-H)肿瘤，占患者少数；占多数的微卫星稳定(MSS)结直肠癌对ICI疗效有限。实体瘤中存在瘤内治疗药物特异性不足、穿透性差的问题，结直肠癌肿瘤微环境(TME)中异常脉管与致密基质架构会限制治疗性抗体局部分布并削弱疗效。肿瘤穿透肽iRGD(internalizing RGD)可通过结合αv整合素并经蛋白酶切暴露CendR基序，介导神经纤毛蛋白1(NRP1)依赖的穿胞转运从而增加共给药药物的瘤内蓄积与深部穿透，但iRGD能否增强结直肠癌中ICI疗效尚不清楚；NRP1在结直肠癌中的表达谱与预后意义既往报道不一致，且其在不同区室（肿瘤细胞、基质、脉管）的功能贡献未明。该研究旨在明确iRGD联合anti-PD-1在结直肠癌模型中的疗效与免疫机制，解析NRP1在各区室中对iRGD介导通透性与治疗反应的贡献，并分析人类结直肠癌中区室特异性NRP1表达及其预后价值，为iRGD为基础的联合策略提供依据。论文发表在《Cancer Research Communications》。

主要关键技术方法：研究人员构建了同源小鼠结直肠癌模型（MSI-H MC38细胞接种C57BL/6小鼠，MSS CT26细胞接种BALB/c小鼠），并利用CRISPR-Cas9系统制备MC38的NRP1敲除(KO)细胞系与空载体(EV)对照；通过体内通透性实验以伊文思蓝(Evans blue)为示踪剂评估iRGD介导的瘤内药物蓄积及其NRP1依赖性（使用抗NRP1阻断抗体与NRP1-KO肿瘤验证）；治疗实验中小鼠分组接受腹腔anti-PD-1抗体联合静脉iRGD、单药或对照处理，监测肿瘤体积与体重；采用免疫组化(IHC)、免疫荧光(IF)与流式细胞术分析瘤内CD8⁺T细胞丰度、增殖(Ki-67)与效应功能(granzyme B)及调节性T细胞比例；人类样本为京都大学医院110例Ⅲ期结直肠癌根治术后标本队列，经IHC分区室（肿瘤细胞、基质、血管内皮CD31⁺）评估NRP1表达并分析其与总生存(OS)、无病生存(DFS)的关系，采用Kaplan–Meier法与Cox比例风险模型进行预后统计分析。

结果：

iRGD enhances NRP1-dependent entry of a coinjected tracer into colorectal cancers（iRGD增强NRP1依赖的共注射示踪剂进入结直肠癌）：研究人员通过在MC38与CT26荷瘤小鼠中静脉共注射伊文思蓝与iRGD，发现iRGD显著提高瘤内染料蓄积且具有肿瘤选择性，该效应可被抗NRP1抗体阻断；MC38-NRP1-KO肿瘤中肿瘤细胞NRP1缺失后，iRGD仍能部分增强染料蓄积，表明基质/脉管NRP1可介导iRGD效应。

iRGD potentiates the antitumor effect of anti–PD-1 antibody treatment in murine colorectal cancer models（iRGD增强anti-PD-1抗体在小鼠结直肠癌模型中的抗肿瘤效应）：在MC38（MSI-H）与CT26（MSS）模型中，iRGD与anti-PD-1联合治疗较anti-PD-1单药显著抑制肿瘤生长并降低终点瘤重，iRGD单药无直接抗肿瘤作用，联合治疗未引起体重明显下降，提示无额外毒性。

Increased abundance of and functional alterations in intratumoral CD8⁺T cells by iRGD and anti–PD-1 combination therapy（iRGD与anti-PD-1联合治疗增加瘤内CD8⁺T细胞丰度与功能改变）：联合治疗组瘤内CD8⁺T细胞数量（IHC、流式）显著高于单药与对照，Ki-67⁺CD8⁺增殖细胞比例与granzyme B⁺细胞增多，CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞比例无显著变化，表明联合治疗通过增强CD8⁺T细胞浸润、增殖与效应功能发挥疗效。

Deleting NRP1 expression in colorectal cancer cells does not abolish the effects of iRGD/anti–PD-1 combination therapy（结直肠癌细胞NRP1缺失不消除iRGD/anti-PD-1联合治疗效果）：MC38-NRP1-KO荷瘤小鼠中联合治疗仍显示肿瘤体积与重量减轻趋势；免疫荧光显示NRP1-KO肿瘤中CD31⁺血管内皮与部分基质细胞仍表达NRP1，提示基质/脉管内皮NRP1足以介导iRGD联合治疗效应；此外MC38-NRP1-KO本身生长慢于EV对照，说明肿瘤细胞内在NRP1促进肿瘤进展。

NRP1 is widely expressed in human colorectal cancer（NRP1广泛表达于人类结直肠癌）：110例Ⅲ期结直肠癌标本IHC显示肿瘤细胞NRP1表达普遍但呈异质性，基质区室>90%病例检出NRP1，约45%为中强阳性；血管内皮细胞NRP1表达模式类似基质；连续切片显示NRP1见于血管关联区(CD31⁺)与非血管基质区(α-SMA⁺癌相关成纤维细胞富集区)，血管区强度更高。

Stromal expression of NRP1 correlates with poor prognosis in colorectal cancer（基质NRP1表达与结直肠癌不良预后相关）：Kaplan–Meier分析表明基质NRP1高表达（而非肿瘤细胞NRP1）显著关联更短OS（P=0.002）与DFS（P=0.008）；血管内皮NRP1高表达也关联更短OS（P=0.012）；多变量Cox回归显示基质NRP1高表达为OS独立不良预后因素（HR=2.783，95%CI 1.040–7.452，P=0.042），此外未接受辅助化疗也为独立因素。

讨论总结：研究人员指出iRGD以NRP1依赖方式选择性增强共给药示踪剂瘤内蓄积，肿瘤细胞NRP1缺失未完全阻断该效应，说明基质/脉管NRP1是关键介质，这与NRP1在血管生成脉管中介导通透性一致。iRGD联合anti-PD-1在MSI-H（MC38）与MSS（CT26）模型中均显著抑制生长，尤其在MSS模型中提示iRGD可能通过突破物理与基质屏障增强ICI瘤内递送与CD8⁺T细胞活化，从而扩展ICI获益人群；但皮下模型未完全模拟人类肿瘤免疫特征，需在原位或基因工程模型中进一步验证。肿瘤细胞NRP1-KO肿瘤生长慢于对照，提示肿瘤细胞内源NRP1促进展，但人类数据中仅基质NRP1具预后价值，可能因人类结直肠癌基质丰富且肿瘤细胞内源NRP1预后信号被基质掩盖；既往NRP1预后不一致源于方法异质性、未分区室评估及队列混杂。该研究发现基质特别是内皮NRP1是iRGD活性关键介质与不良预后因子，支持其作为iRGD为基础联合治疗的可操作靶点及预后标志物，为结直肠癌扩展ICI策略提供依据。结论部分翻译：研究证实iRGD以增强NRP1依赖方式提高共注射药物在结直肠癌瘤内递送；iRGD与anti-PD-1抗体联合治疗在结直肠癌模型中有效抑制肿瘤生长，可能由基质NRP1（尤其肿瘤脉管内皮）介导；基质NRP1表达具临床价值，可预测结直肠癌患者不良预后，支持其作为增强瘤内药物递送的治疗靶点，并为进一步研究iRGD为基础的结直肠癌联合策略提供理论依据。