药物学抑制MAGMAS（PAM16） by BT9减少蛋白质向线粒体基质转运并增敏替莫唑胺（Temozolomide, TMZ）耐药胶质母细胞瘤细胞

《Cancer Research Communications》：Pharmacologic MAGMAS inhibition by BT9 reduces protein trafficking into the... Open Access

　　

摘要：胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM；isocitrate dehydrogenase野生型4级星形细胞瘤）是最具侵袭性且最常见的脑肿瘤，其特征为增殖增加、浸润性、线粒体依赖性改变及坏死。尽管采用最大范围手术切除、放疗及替莫唑胺（Temozolomide, TMZ）标准治疗，GBM仍普遍复发。多数患者在初诊后6～9个月复发，复发后中位生存期不足1年。因此亟需有效治疗策略以克服胶质瘤耐药机制并改善GBM患者长期预后。线粒体相关粒细胞巨噬细胞集落刺激因子分子（Mitochondria-Associated Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor Molecule, MAGMAS；基因名PAM16）是一种核编码线粒体蛋白，为内膜转运酶23（Translocase of the Inner Membrane 23, TIM23）复合物的亚基，功能为调控核编码蛋白向线粒体基质（mitochondrial matrix）的转运。研究人员此前证实MAGMAS在GBM中过表达，且小分子MAGMAS抑制剂BT9可降低线粒体呼吸并对胶质瘤细胞产生体外细胞毒性。本研究探讨MAGMAS在GBM生物学中的作用，以及MAGMAS抑制对TMZ耐药胶质瘤细胞系及患者来源胶质瘤干细胞样细胞（Glioma Stem-like Cells, GSCs）的影响。研究人员观察到复发GBM、化疗耐药胶质瘤细胞及代谢转换过程中PAM16水平升高。BT9与TMZ联合处理较单药显著增加了所有胶质瘤细胞系的死亡率，与其TMZ耐药状态无关。此外，组成性表达shPAM16的GBM细胞在颅内异种移植模型中体外及体内均对TMZ增敏。研究结果表明靶向MAGMAS有望成为GBM新型有效治疗策略。 意义：本研究发现线粒体蛋白MAGMAS与中枢神经系统胶质瘤化疗耐药之间的关联，有助于深入理解线粒体在化疗耐药机制中的重要作用——强调MAGMAS可作为靶点以增强TMZ在化疗耐药细胞中的疗效。

本文对发表于《Cancer Research Communications》的题为"Pharmacologic MAGMAS Inhibition by BT9 Reduces Protein Trafficking into the Mitochondrial Matrix and Sensitizes Temozolomide-Resistant Glioblastoma Cells"的研究论文进行解读。

研究背景：胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM；IDH野生型4级星形细胞瘤）是最常见的原发性恶性脑肿瘤，标准治疗为最大范围手术切除联合放疗及替莫唑胺（Temozolomide, TMZ）化疗，但几乎全部患者会复发，中位总生存期（Overall Survival, OS）仅约14.6个月，5年OS率约7.2%。TMZ耐药是GBM治疗失败的主因，已知机制包括O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（O⁶-methylguanine-DNA methyltransferase, MGMT）介导的DNA修复、碱基切除修复、肿瘤异质性及胶质瘤干细胞样细胞（Glioma Stem-like Cells, GSCs）的存在等，但针对MGMT的抑制剂联合治疗临床获益有限，提示存在其他耐药机制。线粒体通过代谢重编程、活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）调节及凋亡调控参与TMZ耐药。MAGMAS（Mitochondria-Associated Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor Molecule；编码基因PAM16）是内膜转运酶23（Translocase of the inner membrane 23, TIM23）复合物的亚基，调控核编码蛋白向线粒体基质转运，并在高代谢需求组织中高表达，此前已被报道在GBM中过表达且其小分子抑制剂BT9可诱导胶质瘤细胞线粒体功能障碍与凋亡。本研究旨在明确MAGMAS是否参与GBM的TMZ耐药，并评估药理学抑制或基因敲低MAGMAS能否逆转TMZ耐药、增敏现有疗法。

主要关键技术方法：采用TCGA（The Cancer Genome Atlas）与CGGA（Chinese Glioma Genome Atlas）胶质瘤转录组队列分析PAM16在初诊与复发GBM中的表达差异及与MGMT的关联；建立TMZ耐药（TR）及TMZ+O⁶-苄基鸟嘌呤（O⁶-benzylguanine, O⁶-BG）耐药（OTR）胶质瘤细胞系及血清游离诱导的GSC模型；用小分子MAGMAS抑制剂BT9（口服生物利用度好且可穿透血脑屏障）进行药理学干预，慢病毒shRNA敲低PAM16进行遗传学验证；通过稳定同位素标记氨基酸细胞培养（Stable Isotope Labeling by Amino acids in Cell culture, SILAC）质谱分析BT9处理后线粒体蛋白谱变化；MTT/XTT法检测细胞活力，Synergy Finder+软件以最高单一药物效应（Highest Single Agent, HSA）模型计算BT9与TMZ联用协同/加和评分；流式细胞术检测ROS（MitoSOX Red/CellROX）、凋亡（Annexin V-FITC/PI）；Western blot检测线粒体及全细胞蛋白（MAGMAS、TIMM23、LONP1、ACO2、细胞色素c、COXIV、MGMT、NRF1等）；建立NOD-SCID gamma（NSG）小鼠原位颅内异种移植模型（G12-Luc及HOG细胞），给予BT9（30 mg/kg，灌胃）及TMZ（腹腔注射）治疗并记录生存曲线（Kaplan–Meier），活体生物发光成像监测肿瘤负荷。

研究结果：

MAGMAS Levels are Increased in Recurrent GBM Patient Tumor Specimens and TMZ-Resistant Glioma Cell Lines

通过对TCGA与CGGA数据分析，研究人员发现PAM16 mRNA在IDH1野生型复发GBM中显著高于初诊GBM；PAM16与MGMT在初诊GBM标本中呈正相关。TMZ耐药（TR、OTR）胶质瘤细胞系中PAM16表达较亲本敏感株显著升高。经TMZ或丙酮酸脱氢酶激酶抑制剂二氯乙酸（Sodium Dichloroacetate, DCA）诱导氧化磷酸化（Oxidative Phosphorylation, OXPHOS）代谢切换后，PAM16表达上调。将U-251 MG、D-54 MG、T98G在GSC培养基中去分化培养30天后PAM16及CD133⁺干细胞标志物升高，且对TMZ耐药性增强。结论：MAGMAS在复发GBM、TMZ耐药胶质瘤及GSCs中过表达，与TMZ耐药及代谢重编程相关。

Pharmacologic Inhibition of MAGMAS Decreases Protein Trafficking into the Mitochondria

用10 μmol/L BT9处理胶质瘤细胞24 h后，线粒体裂解液中LONP1、乌头酸酶2（Aconitase 2, ACO2）、细胞色素c（Cytochrome c）、细胞色素c氧化酶亚基IV（Cytochrome c Oxidase subunit IV, COXIV）蛋白水平降低，TIMM23（TIM23复合物核心亚基）作为上样对照不变。SILAC质谱显示BT9处理后线粒体中参与有氧呼吸、三羧酸循环及细胞氨基酸分解代谢的蛋白显著减少，包括超氧化物歧化酶2（Superoxide Dismutase 2, SOD2）。BT9使MitoSOX检出的线粒体ROS升高，可被N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine, NAC）部分逆转；BT9诱导早期/晚期凋亡细胞比例由对照约13%升至30.7%，联用NAC后降至13.6%。结论：BT9通过抑制MAGMAS阻断核编码蛋白向线粒体基质转运，导致线粒体蛋白稳态失调、ROS累积及胶质瘤细胞凋亡。

BT9 is Effective Against TMZ-Resistant Glioma Lines and GSC and Has Limited Toxicity Against Human Astrocytes (HAs)

BT9对TMZ敏感及TMZ耐药（TR、OTR）胶质瘤细胞系的IC₅₀无显著差异（约2.97～6.27 μmol/L），对患者来源GSC（DB93、G12、G85）IC₅₀为1.69～3.25 μmol/L；正常人星形胶质细胞（Human Astrocytes, HAs）IC₅₀＞8 μmol/L，治疗窗较宽。BT9与TMZ联用在多数细胞系呈加和（additive）效应，在DB93与T98G中HSA评分＞10呈协同（synergistic）效应。原位移植G12-Luc NSG小鼠模型中BT9单药未显著延长生存期，TMZ单药延长生存期，BT9+TMZ联合较TMZ单药进一步延长生存期（P=0.0790），较vehicle及BT9单药显著延长（P＜0.005）。结论：BT9可有效杀伤TMZ耐药胶质瘤及GSCs且对正常星形胶质细胞毒性较低，与TMZ联用可增强体内外抗GBM效果。

MAGMAS Inhibition with BT9 Sensitizes GSC and TMZ-Resistant Glioma Cells to TMZ

体外浓度梯度BT9（0～10 μmol/L）与TMZ（0～1000 μmol/L）联用显著降低各胶质瘤及GSC系存活率，Synergy Finder+ HSA评分显示除两株细胞呈弱拮抗外其余为加和至协同。原位模型中BT9+TMZ组较TMZ单药有生存期延长趋势。结论：药理学抑制MAGMAS可使TMZ耐药及GSC对TMZ再敏化。

MAGMAS Knockdown in GBM Cells Increases Sensitivity to TMZ, Radiation, and TTFs（肿瘤电场治疗 Tumor Treating Fields）

慢病毒shPAM16敲低U-251 MG、T98G、G12、HOG中PAM16后，MGMT mRNA及核呼吸因子1（Nuclear Respiratory Factor 1, NRF1）蛋白水平下调。shPAM16细胞经TMZ处理后死亡增加，基础ROS升高，克隆形成能力下降。shPAM16细胞对放疗（0～6 Gy）及200 Hz TTFs敏感性增加（PI⁺死细胞比例高于scramble对照）。原位G12-Luc异种移植NSG小鼠中，shPAM16+TMZ组较scramble+TMZ、shPAM16+vehicle及scramble+vehicle显著延长OS（shPAM16+TMZ组全部存活至研究终点）；HOG shPAM16+TMZ组中位OS＞150天。结论：遗传敲低MAGMAS使GBM细胞对TMZ、放疗及TTFs增敏，并在体内与TMZ联用显著延长荷瘤小鼠生存期。

讨论与结论翻译：GBM是最具侵袭性的CNS肿瘤之一。尽管标准治疗，患者预后极差。TMZ耐药机制复杂，包括肿瘤异质性、免疫抑制微环境、GSCs、线粒体重编程及DNA修复通路激活。本研究确定线粒体蛋白MAGMAS在复发GBM患者标本、TMZ耐药胶质瘤细胞系及GSCs中过表达；PAM16与MGMT正相关，提示MAGMAS参与线粒体介导的TMZ耐药。MAGMAS通过调节DNAJC19的ATP酶刺激活性调控线粒体基质蛋白转运，并作为ROS调节因子。获得TMZ耐药过程中胶质瘤细胞从有氧糖酵解切换至OXPHOS，MAGMAS过表达可能促进此代谢重编程。BT9抑制MAGMAS减少ETC复合物组装所需前体蛋白入膜，降低OXPHOS，增加超氧阴离子致ROS累积。BT9对TMZ耐药与敏感细胞杀伤效力相当，与TMZ联用呈加和至协同效应并在体内延长生存期。PAM16敲低使GBM细胞对TMZ、放疗及TTFs增敏并在原位模型中与TMZ联用显著延长OS。综上，抑制MAGMAS干扰线粒体蛋白转运与稳态，削弱胶质瘤细胞氧化磷酸化适应及ROS解毒能力，恢复TMZ耐药GBM对TMZ的敏感性，靶向MAGMAS/PAM16为GBM特别是TMZ耐药复发病例提供了潜在新型联合治疗策略。