线粒体相关粒细胞巨噬细胞集落刺激因子分子（MAGMAS）在新诊断与复发性胶质母细胞瘤中的差异性表达及其化疗增敏作用研究

《Cancer Research Communications》：MAGMAS is differentially expressed in newly diagnosed vs. recurrent GBM pat... Open Access

　　

胶质母细胞瘤（GBM，异柠檬酸脱氢酶野生型4级星形细胞瘤)是最具侵袭性和最常见的脑肿瘤，其特征包括增殖增强、侵袭性、线粒体依赖性改变和坏死。尽管采用最大范围手术切除、放疗和替莫唑胺(TMZ)的标准治疗方案，GBM复发仍不可避免。大多数患者在初次诊断后6至9个月内复发，且复发后的中位生存期不足一年。因此，需要有效的治疗策略来克服胶质瘤耐药机制并改善GBM患者的长期预后。线粒体相关粒细胞巨噬细胞集落刺激因子分子(MAGMAS, PAM16)是一种核编码的线粒体蛋白，为内膜转位酶23(TIM23)复合物的亚基，其功能是蛋白质向线粒体基质转运的关键调节因子。研究人员此前已证明MAGMAS在GBM中过表达，且小分子MAGMAS抑制剂BT9可降低线粒体呼吸并对胶质瘤细胞产生体外细胞毒性。在本研究中，研究人员探讨了MAGMAS在GBM生物学中的作用以及MAGMAS抑制对TMZ耐药胶质瘤细胞系和患者来源胶质瘤干细胞样细胞的影响。研究人员观察到复发性GBM、化疗耐药胶质瘤细胞及代谢转换过程中PAM16水平升高。BT9与TMZ联合处理在所有胶质瘤细胞系中均较单药显著增加细胞死亡，无论其TMZ耐药状态如何。此外，稳定表达shPAM16的GBM细胞在体外及颅内异种移植模型中对TMZ增敏。研究结果表明，靶向MAGMAS有望成为一种新型有效的治疗GBM的策略。研究意义：该研究发现了线粒体蛋白MAGMAS与胶质瘤中枢神经系统肿瘤化疗耐药之间的联系。这些发现有助于深化对线粒体在化疗耐药机制中重要作用的理解——凸显MAGMAS作为增强TMZ在化疗耐药细胞中疗效的靶点价值。

该研究发表于《Cancer Research Communications》，聚焦于胶质母细胞瘤(GBM)治疗中最为棘手的化疗耐药问题。GBM是最常见且最具侵袭性的原发性脑肿瘤，5年总生存率仅为7.2%，中位生存期仅14.6个月。尽管当前标准治疗包括最大范围手术切除、放疗和替莫唑胺(TMZ)化疗，加之美国食品药品监督管理局(FDA)批准的肿瘤电场治疗(TTF)外，大多数肿瘤仍在初次诊断后一年内复发。TMZ作为DNA烷化剂，通过甲基化O6-鸟嘌呤残基产生细胞毒性，但胶质瘤细胞可通过上调O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)等DNA修复通路获得耐药性。更令人关注的是，即便联合MGMT抑制剂O6-苄基鸟嘌呤(O6-BG)亦未能显著改善复发GBM患者生存，提示存在MGMT非依赖性的额外耐药机制。

线粒体在TMZ耐药发展中扮演关键角色，涉及代谢重编程、凋亡调控、细胞增殖、线粒体生物发生及活性氧(ROS)产生改变等多重机制。线粒体相关粒细胞巨噬细胞集落刺激因子分子(MAGMAS, PAM16)作为核编码的线粒体内膜蛋白，是线粒体内膜转位酶23(TIM23)复合物亚基，调控核编码线粒体蛋白向基质的转运。MAGMAS在代谢活跃组织(脑、骨骼肌、心肌)及多种癌症中过表达，且能增强细胞对氧化应激的耐受性、提高电子传递链(ETC)活性。BT9是一种新型、具有脑穿透性的小分子MAGMAS抑制剂，此前已被证明可诱导线粒体功能障碍和凋亡。基于此背景，研究人员推测MAGMAS可能通过促进线粒体蛋白转运参与TMZ耐药机制，抑制MAGMAS有望增强TMZ疗效。

研究人员采用的主要关键技术方法包括：利用中国胶质瘤基因组图谱(CGGA)和癌症基因组图谱(TCGA)数据库分析PAM16表达；建立TMZ耐药细胞系(U-251 MG-TR/OTR、D-54 MG-TR/OTR)及患者来源胶质瘤干细胞样细胞(GSC)和患者来源异种移植(PDX)模型；运用定量PCR和蛋白质印迹检测基因蛋白表达；通过MTT/XTT法测定细胞活力；采用稳定同位素标记氨基酸细胞培养(SILAC)联合质谱进行蛋白组学分析；利用MitoSOX Red和CellROX探针结合流式细胞术检测ROS；通过Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)双染评估凋亡；构建shRNA慢病毒介导的PAM16敲除胶质瘤细胞系；使用Novocure Inovitro系统进行肿瘤电场治疗体外实验；建立NOD-SCID gamma(NSG)小鼠颅内原位异种移植模型，结合荧光素酶活体成像监测肿瘤生长；采用Synergy Finder+软件进行药物协同效应分析。

研究结果部分：

MAGMAS水平在复发GBM患者肿瘤标本及TMZ耐药胶质瘤细胞系中升高。研究人员通过CGGA和TCGA数据库比较发现，复发GBM肿瘤中PAM16 mRNA水平显著高于新诊断患者。PAM16与MGMT表达呈强正相关(CGGA: R=0.7869; TCGA: R=0.2773)。在建立的TMZ耐药细胞系(U-251 MG-TR/OTR、D-54 MG-TR/OTR)中，PAM16表达显著高于敏感亲本细胞系。TMZ处理U-251 MG和T98G细胞3天后PAM16升高；糖酵解抑制剂二氯乙酸钠(DCA)处理亦显著增加PAM16 mRNA和蛋白水平，提示MAGMAS参与代谢转换。将U-251 MG、D-54 MG和T98G细胞在去血清GSC培养基中培养30天诱导去分化后，PAM16表达升高且获得TMZ耐药性，同时CD133⁺细胞比例增加。

BT9药理学抑制MAGMAS减少线粒体蛋白转运。BT9(10 μmol/L)处理24小时后，U-251 MG、D-54 MG细胞线粒体裂解物中LONP1、COXIV、细胞色素C和ACO2蛋白水平降低。SILAC蛋白组学分析显示BT3处理显著降低的蛋白参与有氧呼吸、三羧酸循环和细胞氨基酸分解代谢过程。BT9显著增加ROS产生，该效应可被抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)部分淬灭。BT9增加早期/晚期凋亡(Annexin V⁺/PI⁺)细胞比例30.7%及坏死(Annexin V^-/PI⁺)细胞比例15.1%，NAC联合处理后分别降至13.6%和3.3%。在G12胶质瘤干细胞中，BT9单独处理使活细胞降至25.9%，TMZ降至38.1%，联合处理仅11.5%存活。

BT9对TMZ耐药胶质瘤细胞系和GSC有效且对正常星形胶质细胞毒性有限。BT9在TMZ耐药系(TR和OTR)与敏感亲本系中IC₅₀相似(2.97-6.27 μmol/L)，对患者来源GSC系DB93(IC₅₀=1.69 μmol/L)和PDX系G12(IC₅₀=2.02 μmol/L)、G85(IC₅₀=3.25 μmol/L)亦有效，而正常人星形胶质细胞(HA)IC₅₀>8 μmol/L，显示良好治疗指数。

BT9联合TMZ增敏GSC和TMZ耐药胶质瘤细胞。3D协同分析显示BT9与TMZ联合在所有测试细胞系中均产生高于单药的细胞毒性降低效应。DB93和T98G的最高单剂(HSA)协同评分>10，显示协同效应；其他细胞系评分为-10至+10之间，显示相加效应。G12-Luc颅内原位模型中，BT9(30 mg/kg)联合TMZ(10 mg/kg)较TMZ单药有生存期延长趋势(P=0.0790)，且有一小鼠未出现健康衰退或肿瘤生长。

MAGMAS敲除增加GBM细胞对TMZ、放疗和TTF的敏感性。shPAM16稳定转导的U-251 MG、T98G、G12和HOG细胞中，MGMT mRNA和核呼吸因子1(NRF1)蛋白水平降低。PAM16敲除使U-251 MG和HOG对TMZ诱导的细胞死亡增敏，且U-251 MG、T98G和G12敲除细胞ROS水平显著升高。克隆形成实验中，PAM16敲除的T98G和U-251 MG细胞经0-6 Gy辐射后集落形成能力较对照降低。PAM16敲除的U-251 MG和T98G细胞对200 Hz TTF敏感性亦增强。

MAGMAS敲除联合TMZ延长原位胶质瘤小鼠模型生存期。G12-Luc-shPAM16颅内移植NSG小鼠中，sh1-TMZ组在整个研究期间存活且无健康衰退或肿瘤迹象，较scramble-TMZ组(P=0.0018)和sh1-vehicle组(P=0.0021)显著延长生存。HOG-shPAM16模型中，sh1-TMZ组中位生存>150天，较sh1-vehicle(P=0.0002)和scramble-TMZ(P=0.0597)显著延长。

讨论部分总结：

GBM作为侵袭性最强的中枢神经系统肿瘤之一，当前治疗仅能适度延长患者生存，多数肿瘤在初次诊断后一年内复发。肿瘤异质性、免疫抑制性肿瘤微环境、GSCs、线粒体重编程及DNA修复通路激活等多重因素参与耐药机制。该研究发现MAGMAS在复发GBM、TMZ耐药细胞系和GSCs中过表达，且PAM16与MGMT表达正相关，提示其参与线粒体介导的TMZ耐药。CD133(PROM1)作为GSC标志物，调控化疗耐药、静息状态、肿瘤复发等关键通路，研究中观察到去分化过程中PAM16与CD133表达同步升高。

TMZ暴露后胶质瘤细胞通过增强线粒体功能、增加氧耗进行代谢转换。急性TMZ处理和DCA处理均增加PAM16表达，提示MAGMAS水平升高有助于通过增加蛋白转运能力促进代谢重编程。BT9作为MAGMAS小分子抑制剂，可减少ETC复合物组装所需前体蛋白亚基的转运，增加超氧化物产生，与TMZ联合在所有测试细胞系中产生协同或相加效应，体内联合治疗亦延长生存期。

遗传学手段敲除MAGMAS后，细胞对TMZ、放疗和TTF均更敏感。G12-Luc和HOG原位模型中，PAM16敲除联合TMZ显著延长生存期，尤其GSC来源的G12模型显示shPAM16细胞对MAGMAS disruption更为敏感。这些发现支持MAGMAS抑制联合现有治疗可能具有未来临床相关性。

研究结论部分翻译：

大多数GBM患者在治疗后一年内经历肿瘤复发，由于化疗和放疗耐药，临床治疗方案有限。为开发可与标准治疗联合的新型治疗化合物，有必要了解细胞在急性及晚期耐药阶段被化疗药物暴露后触发的细胞反应机制。研究结果表明，MAGMAS在化疗耐药中发挥重要作用，其抑制通过联合处理使耐药细胞对TMZ增敏。通过抑制MAGMAS，研究人员阻断了包括LONP1、ACO2、COXIV和细胞色素C在内的必需核编码蛋白向线粒体的转运。这些关键蛋白维持线粒体稳态和氧化磷酸化(OXPHOS)能量代谢。LONP1是一种在不同癌症中高表达且与不良预后相关的必需线粒体蛋白。降低LONP1水平会进一步增加线粒体应激、ROS积累和生物能量受损，正如先前报道。此外，抑制该通路增加蛋白水解应激并降低能量代谢，使细胞对TMZ变得脆弱。需要进一步研究阐明MAGMAS的作用机制。总之，研究结果表明，通过抑制MAGMAS从而抑制线粒体蛋白转运来破坏线粒体稳态，可能恢复TMZ耐药GBM对TMZ的敏感性，从而为改善GBM患者预后提供潜在治疗策略。