《Nature Microbiology》：Immunogenicity of poxvirus A16/G9 entry–fusion subcomplex and its restriction by A56/K2 protein informs vaccine design
编辑推荐：
痘病毒依赖一个保守的多蛋白进入–融合复合体（entry–fusion complex，EFC），这为抗体识别提供了多个潜在靶点，尽管目前仅有少数相关蛋白的免疫原性被系统分析。研究人员在兔和小鼠免疫实验中检测了10种正痘病毒进入–融合复合体蛋白的胞外结构域（ec
痘病毒依赖一个保守的多蛋白进入–融合复合体（entry–fusion complex，EFC），这为抗体识别提供了多个潜在靶点，尽管目前仅有少数相关蛋白的免疫原性被系统分析。研究人员在兔和小鼠免疫实验中检测了10种正痘病毒进入–融合复合体蛋白的胞外结构域（ectodomains），并确定其中6种能够诱导中和抗体。聚焦于位于复合体顶端的A16/G9异源二聚体（heterodimer），研究显示其可诱导阻断痘苗病毒（vaccinia virus，VACV）入侵的抗体，并可交叉中和牛痘病毒（cowpox virus，CPXV）和猴痘病毒（monkeypox virus，MPXV），同时保护小鼠抵御VACV和CPXV致死性攻击感染。然而，在减毒或强毒VACV、CPXV或MPXV感染后，仅能有限检测到针对A16/G9的抗体；相反，分泌G9的重组VACV，或缺失编码病毒融合抑制复合体A56/K2基因的VACV，则能够稳健诱导此类抗体，而A56/K2可特异性结合A16/G9。该研究鉴定出先前未被认识、可纳入重组疫苗的新型免疫原，并阐明了A56/K2复合体介导的一种免疫逃逸方式。
该论文发表于《Nature Microbiology》，围绕正痘病毒（orthopoxviruses，OPXVs）疫苗设计中的关键瓶颈展开：现有天花/猴痘疫苗虽能减轻重症，却对MPXV诱导的中和抗体水平较低且持久性不足，因而亟需寻找更优的抗原靶点。与多数包膜病毒不同，痘病毒的融合入侵并非依赖单一表面糖蛋白，而是依赖由11种高度保守蛋白组成的进入–融合复合体（EFC）。这一复合体各组分原则上均可能成为体液免疫攻击对象，但过去仅有极少数蛋白被证实能够诱导中和抗体，因此哪些EFC组分具备真正的保护性免疫原价值，仍不清楚。研究人员据此系统评估多个EFC蛋白胞外结构域的免疫原性，并重点解析A16/G9异源二聚体的保护作用及其在天然感染中免疫原性受限的原因。研究最终表明，A16/G9是可诱导跨正痘病毒中和抗体和体内保护的新型优选免疫原，但在天然病毒感染或常规减毒活疫苗免疫条件下，这一靶标往往难以有效暴露并诱导抗体；进一步证据显示，病毒融合抑制复合体A56/K2通过特异性结合A16/G9并限制其膜暴露，从而构成一种免疫逃逸机制。该研究的重要意义在于：不仅扩展了正痘病毒疫苗候选抗原谱，也从病毒入侵生物学和抗原呈递角度，为下一代多组分重组疫苗设计提供了明确方向。
在技术方法方面，研究主要采用了以下几类关键策略：其一，表达并纯化多种EFC蛋白胞外结构域，在兔和BALB/c小鼠中进行蛋白免疫；其二，结合ELISA、免疫印迹（western blot）、病毒中和实验以及病毒结合/入侵抑制实验，评价抗体的结合特性与功能活性；其三，利用AlphaFold3构建EFC核心及全复合体结构模型，并结合已知结构数据进行空间定位分析；其四，采用VACV和CPXV致死攻击模型、活体生物发光成像（bioluminescent imaging，BLI）评估体内保护效果；其五，构建分泌型G9重组MVA及A56/K2缺失VACV，以检验抗原暴露方式对免疫原性的影响。样本来源除实验动物外，还包括JYNNEOS疫苗接种人血清以及MVA免疫或MPXV感染的恒河猴血清。
研究结果
Neutralizing activities of antisera correlate with binding to intact virions
研究人员首先系统检测多个EFC蛋白的免疫原性。通过对7种单独表达的EFC蛋白胞外结构域进行兔免疫，发现抗A28、抗F9、抗L1和抗J5血清可中和VACV，而抗H2、抗L5和抗A21血清虽能识别解离病毒颗粒中的相应抗原，却几乎不具备中和活性。进一步比较发现，凡是能够诱导中和抗体的蛋白，其免疫血清对完整病毒颗粒的结合能力也更强，提示对完整病毒表面的可及性与中和功能密切相关。研究人员随后分析L5/G3同源蛋白复合体M5/G2，结果表明该异源二聚体虽可诱导与抗原及解离病毒结合的抗体，但对完整病毒结合较弱，既不能有效中和VACV，也不能保护小鼠免于攻击后的体重下降。由此说明，并非所有EFC组分都适合作为保护性疫苗抗原。
A16/G9 heterodimer induces potent neutralizing antibodies
随后研究聚焦于形成稳定异源二聚体的A16和G9。重组表达结果显示，G9可促进A16的折叠与分泌，提示G9具有伴侣样作用。小鼠免疫后，A16/G9异源二聚体诱导出强烈的结合抗体反应，并且与单独A16或G9相比，诱导的VACV中和活性更高。该抗体不仅能结合蔗糖梯度纯化的完整病毒颗粒，也能识别感染细胞表面的病毒颗粒。功能上，A16/G9免疫所得抗体可交叉中和MPXV和CPXV，符合EFC蛋白在正痘病毒中的高度保守性。进一步实验表明，此类抗体主要通过抑制病毒进入过程发挥作用，而非阻断病毒与细胞的初始结合。
Locations of targets of neutralizing and non-neutralizing antibodies within an EFC model
为理解中和与非中和靶点差异，研究人员利用AlphaFold3建立了9蛋白核心结构与11蛋白全EFC模型，并通过已知胞外结构和二硫键配对信息验证模型可靠性。模型显示，G3、L5、A21和O3位于底部，H2与A28形成桥接层，A16、G9和J5则位于顶部。将免疫学数据映射至模型后发现，诱导中和抗体的靶标主要位于EFC顶端或相对外露区域，包括A16、G9、J5以及其下方的A28、F9和L1；而非中和靶标L5、A21、G3、O3及H2则集中于底部区域，提示这些区域可能被病毒膜环境或其他复合体组分遮蔽，因而虽具抗原性却缺乏有效的中和表位暴露。
Neutralizing antibodies to G9 and A16 correlate with protection
在体内保护实验中，A16、G9或A16/G9免疫均可显著减轻小鼠经鼻VACV攻击后的体重下降，并提高存活率，其中A16/G9保护效果最佳。利用表达萤火虫荧光素酶的VACV进行活体成像后发现，免疫组在头部和身体的病毒复制与扩散信号均较对照组更快减弱，说明其不仅改善结局，也限制了体内病毒扩增。进一步的跨病毒保护实验表明，A16/G9免疫还能使小鼠在致死剂量CPXV攻击下获得显著生存优势。研究人员又将A16/G9与胞外包膜病毒（extracellular enveloped virion，EV）蛋白A35、B6联合免疫，结果在高剂量VACV攻击中，A16/G9+A35+B6组表现出最稳定的体重维持，提示MV相关入侵抗原与EV传播相关抗原联合可实现更全面的保护。
Antibodies binding to A16 and G9 are rarely detected following OPXV infections
尽管A16/G9作为重组蛋白具有良好免疫原性，研究却发现，在MVA、致病性VACV、CPXV或MPXV感染后，针对A16/G9的抗体通常极少或无法检出。无论是在感染或免疫后的小鼠、兔、恒河猴，还是接种JYNNEOS疫苗的人群血清中，均可检测到针对H3等优势抗原的抗体，但A16/G9抗体明显缺失。即便先以可溶性A16/G9进行初免，再以MVA加强，也未见MVA显著增强A16/G9抗体反应。这一结果鲜明表明：A16/G9虽具抗原性并能被外源蛋白免疫有效激发，但在病毒天然感染背景下免疫原性受抑，体现了抗原性（antigenicity）与免疫原性（immunogenicity）的明显分离。
Overcoming suppression of A16/G9 immunogenicity
为解释这种受限免疫原性，研究人员构建了分泌型G9重组MVA（rMVA-G9）。结果显示，该重组病毒在多种细胞中的复制能力与亲本MVA相近，但感染后可将G9分泌至培养上清，并在小鼠体内成功诱导出明显的抗G9抗体，而亲本MVA则不能。这证明可溶性、可暴露的G9能够被免疫系统有效识别。进一步，研究将目光转向与A16/G9特异结合的融合抑制复合体A56/K2。A56/K2通常晚期表达并插入细胞膜，结合子代病毒表面的A16/G9，抑制病毒回融入母细胞及细胞–细胞融合。研究人员发现，感染A56/K2缺失突变VACV的小鼠能够产生A16/G9抗体，而感染野生型VACV者则不能。该结果支持如下机制：缺失A56/K2后，子代病毒回融入母细胞膜，将EFC尤其是A16/G9暴露于质膜表面，从而使B细胞能够识别并被激活，最终产生相应抗体。因此，A56/K2不仅是融合抑制因子，也参与限制某些EFC蛋白的免疫原性。
讨论与结论
讨论部分强调，正痘病毒EFC虽然由多蛋白组成、潜在抗体靶点丰富，但真正能够稳定诱导中和抗体的主要是位于EFC顶端、对完整病毒更可及的部分。A16/G9异源二聚体是其中尤为突出的新型靶点：其一，序列高度保守，可诱导针对VACV、CPXV和MPXV的交叉中和抗体；其二，可在小鼠中提供对VACV和CPXV的显著保护；其三，与EV抗原联用时可进一步增强整体保护效果。研究同时指出，A16/G9在天然感染和现有减毒活疫苗背景下抗体反应微弱，并非因为缺乏中和价值，而是由于其在病毒颗粒中被膜结构和相关蛋白复合体遮蔽，难以有效触发B细胞识别。A56/K2通过结合A16/G9并阻止其在细胞膜上的暴露，构成了正痘病毒特有的免疫逃逸机制之一。研究者据此提出，未来多组分疫苗可考虑纳入A16/G9，并通过分泌型表达或A56/K2缺失等设计提高其免疫原性，从而优于现有疫苗策略。论文亦指出本研究未进一步解析被动抗体转移保护效应，也未系统评估细胞免疫在保护中的贡献，这是后续研究的重要方向。
研究结论部分可译为：
痘病毒入侵与融合所需的大量蛋白为宿主免疫系统提供了众多潜在靶点。在11种EFC蛋白中，有6种能够诱导中和抗体，这些靶点主要位于AlphaFold3预测模型的EFC顶端区域。研究聚焦于位于EFC顶部展示的A16/G9异源二聚体。A16和G9无论单独还是以异源二聚体形式免疫，均可在小鼠中诱导针对VACV、CPXV和MPXV的交叉中和多克隆抗体，并在致死性VACV感染中提供保护，同时还可对致死性CPXV感染产生交叉保护。A16/G9结合EV蛋白后可进一步增强保护作用。尽管如此，A16/G9在接种JYNNEOS MVA疫苗或感染致病性VACV、CPXV、MPXV后的鼠、猴及人群中几乎不诱导可检测抗体。可溶性G9重组MVA能够恢复这种抗体诱导能力，而缺失A56/K2的VACV同样能够诱导A16/G9抗体，说明A56/K2通过限制A16/G9暴露而抑制其免疫原性。总体而言，A16和G9是适合纳入新型多组分正痘病毒疫苗的优选抗原，而表达分泌型EFC蛋白或缺失A56/K2的减毒活疫苗也可能具备相较当前疫苗更大的优势。
