利用分子信标以单分子分辨率评估体外转录过程

《Scientific Reports》：Employing molecular beacons to assess in vitro transcription with single-molecule resolution

　　

摘要

转录是细胞中一个至关重要的过程，其中RNA聚合酶根据DNA模板生成信使RNA（mRNA）。已经开发出许多转录系统，以便在体外以及巨型单层囊泡（GUVs）的封闭环境中复制这一过程。然而，这些系统及其相关研究通常使用的DNA浓度远高于自然细胞中的DNA浓度，而自然细胞中通常只含有一份DNA拷贝。在这项工作中，我们引入了单分子体外转录（smIVT）技术，该技术克服了这一限制，使得能够在溶液中以及GUVs内部可视化并追踪单个mRNA分子。我们通过使用一种分子信标来实现这一目标：这种信标是一种被抑制的RNA或DNA发夹探针，在与转录产物mRNA结合后会发出荧光；同时使用编码该分子信标结合序列32个重复序列的模板DNA。通过这些方法，我们确保了足够的信噪比以检测到单个mRNA分子。我们利用smIVT技术比较了各种市售体外转录试剂盒的性能，并定量描述了GUVs内部的单分子转录过程。我们认为，smIVT是一种能够以单分子分辨率详细研究体外转录过程的杰出技术。