MiR-23c调控EGFR突变型非小细胞肺癌细胞对吉非替尼(Gefitinib)耐药性的作用机制研究

《Cells》：MiR-23c Regulates the Resistance to Gefitinib in EGFR Mutant Non-Small-Cell Lung Cancer Cells

　　

代谢状态强烈影响社会与繁殖行为，但将内部能量信号转化为行为反应的神经环路尚不清楚。下丘脑腹侧前乳头体核(PMv)尤其是表达瘦素受体(LepRb)的神经元被认为参与此过程，但其全脑环路构筑仍不明确。研究人员利用LepRb-Cre小鼠，采用Cre依赖的逆行(狂犬病病毒RV)和顺行(单纯疱疹病毒HSV)病毒示踪技术，构建了PMvLepRb神经元在单细胞分辨率的全面输入-输出图谱。三维重建显示这些神经元接收密集汇聚性输入，主要来自参与能量平衡、动机及边缘处理的下丘脑和前脑区；而其输出不仅回馈若干输入区，还显著投射至中脑及脑桥自主神经中枢，包括导水管周围灰质(PAG)和臂旁核(PB)。定量分析表明前脑区多参与交互性连接，而脑干区以传出投射为主。该组织结构提示PMvLepRb神经元可整合代谢与动机信号，并将其传递至控制本能行为与自主反应的下流系统，为理解能量状态如何影响与社会竞争和繁殖相关的决策提供了结构基础。

研究背景与目的

能量不足时限能昂贵的社会与繁殖行为被抑制，能量充足时则被允许，这一"门控"机制的神经基础尚不明确。下丘脑(hypothalamus)是稳态与动机行为的整合中枢，其中腹侧前乳头体核(premammillary nucleus, ventral part, PMv)被认为是连接代谢信号与社会/生殖功能的关键节点。PMv富含瘦素受体(leptin receptor, LepRb)且主要为Vglut2阳性兴奋性神经元，既往研究表明PMv^LepRb神经元参与青春期启动、促性腺激素调节及能量平衡，但其细胞类型特异的全脑输入-输出连接图谱缺乏。本研究旨在利用细胞类型特异性病毒示踪技术，绘制PMv^LepRb神经元在全脑范围的单突触输入与输出连接，阐明其如何整合多元上游信号并投射至下游驱动行为的结构基础。该论文发表于《Cells》。

主要关键技术方法

研究人员选用16只雄性LepRb-Cre小鼠(Jackson Laboratory, #008320)，年龄P56–P84，分为逆行(rabies病毒RV, n=8)与顺行(单纯疱疹病毒H129株 HSV, n=8)单突触病毒示经组，经组织学质控后最终纳入5只RV组与5只HSV组进行全脑分析。采用Cre依赖双病毒系统：(1)逆行单突触示踪——PMv共注射AAV-EF1α-DIO-TVA-EGFP与AAV-EF1α-DIO-RG，两周后注射RV-EnvA-ΔG-mCherry，标记PMv^LepRb神经元的上游单突触输入；(2)严格顺行单突触示踪——PMv共注射AAV-hSyn-DIO-mCherry-Her2CT2与AAV-UL26.5-DIO-cmgD，两周后注射H.129-ΔgD-hUbC-EGFP-scHer2::gD，标记PMv^LepRb神经元的下游单突触输出。灌注取脑后行免疫荧光染色，全脑冠状切片通过QuPath+Cellpose进行胞体分割，利用ABBA插件非线性配准至Allen CCFv3(Common Coordinate Framework version 3)，用Python及brainrender进行3D重构与量化统计，连接强度经log₁₀(x+1)转换及Z-score标准化并按阈值划分配对模块，统计学用Mann–Whitney U检验与层次聚类。

研究结果

3.1. Viral Tracing Strategies for Mapping the Brain-Wide Inputs and Outputs of PMv^LepRbNeurons

研究人员通过Cre依赖RV与HSV双病毒策略验证PMv^{LepRb神经元单突触逆行与顺行示踪的有效性。组织学确认辅助AAV与RV或HSV均在PMv局限表达，双标细胞为起始神经元(starter neurons)，仅mCherry或EGFP标记细胞分别为单突触输入或输出神经元，3D空间映射证实定位准确，验证了两种病毒示踪体系可用于全脑连接分析。}

3.2. Global Architecture of the PMv^LepRbAfferent and Efferent Networks

研究人员对5只小鼠全脑系列切片分析RV-mCherry标记的输入神经元与HSV-EGFP标记的输出神经元分布。三维映射显示输入与输出沿前后轴呈广泛而有序分布。定量显示PMv^LepRb神经元62.13%输入来自下丘脑(hypothalamus, HY)，其次为纹状体(striatum, STR, 11.77%)、苍白球(pallidum, PAL, 11.12%)及皮层下板(cortical subplate, CTXsp, 5.7%)，具体密集输入源于内侧视前区(MPO)、内侧视前核(MPN)、腹内侧下丘脑(VMH)及弓状核(ARH)，以及终纹床核(BST)、外侧隔核(LSr、LSv)、内侧杏仁核(MEA)和海马CA1。输出仍以下丘脑为主(45.28%)，但明显差异在于PMv^LepRb神经元向中脑(midbrain, MB, 13.58%)与脑桥(pons, P, 5.9%)发出密集下行投射(尤至导水管周围灰质PAG、中缝核MRN、臂旁核PB)，而这些区域几无逆向输入，提示不对称连接组：PMv^LepRb神经元整合前脑与下丘脑输入并形成局部交互连接后，将信号中继至中脑干与脑桥自主中枢。

3.3. Quantitative Profiling of Brain-Wide Afferent and Efferent Nuclei of PMv^LepRbNeurons

研究人员在5只/组中共鉴定67,135个输入神经元与120,957个输出神经元，量化各核团占全脑总输入/输出比例(>0.05%者展示)。最强输入源为BST(9.3%)，其次MPN(8.6%)、PMv自身微环路(6.9%)、PVp(5.1%)、ARH(4.2%)等下丘脑核团及LSv(3.8%)、LSr(3.1%)、MEA(2.8%)、CA1(2.5%)等。输出靶区中MEA(7.5%)、BST(4.7%)、外侧隔(LSr 1.8%)及下丘脑AHN(5.9%)、LHA(3.9%)、MPN(3.7%)等密度高，并明确投射至PAG(5.1%)、MRN(2.5%)、PB(1.8%)。经log转换与Z-score标准化划分四象限模块：High-In/High-Out(如BST、MEA、MPN)具强交互互惠；Low-In/High-Out富集PAG、MRN、PB等几乎无逆向反馈的下游自主中枢；High-In/Low-Out含主要提供输入但非主要输出靶区(如PVH)。统计与层次聚类热图证实个体间一致性及模块划分合理性。全脑比例权重图谱直观呈现前后脑与脑干区域输入输出差异。

讨论与结论总结

研究人员讨论指出，本研究首次绘制了PMv^LepRb神经元全脑单突触输入-输出连接图谱。PMv^LepRb神经元接受来自176个脑区(主要是下丘脑与边缘系统)的代谢、社会、情绪及生殖相关信号汇聚输入——包括ARH、VMH、PVH、LHA等能量调节中枢及MEA、LS、BST、CA1等社会/环境信息处理区，MPO与MPN提供生殖控制直接投射，使其成为代谢-社会-生殖通路解剖交汇点。输出网络涵盖223个靶区，在下丘脑内形成反馈调节，与前脑边缘区(BST、MEA、LS)强相互投射，并显著不对称地向中脑/脑桥自主中枢(PAG、MRN、PB)发出下行投射而无显著逆向输入，构成潜在"自上而下"调制本能行为与生理反应的架构。在雄性特异性功能中，PMv^LepRb神经元接收犁鼻系统传递的雄-雄社会信号，投射至VMH(攻击行为)与PAG(姿势调整、社会地位)、PB(心肺自主动员)，能量充足时瘦素具允许效应启动耗能性社会竞争与求偶，能量匮乏时PMv兴奋性降低抑制非必需争斗与求偶以避免致命能耗。作者也指出局限性：仅雄性小鼠、静态解剖连接无法证明功能因果、未细分PMv^LepRb亚群及代谢病模型下变化，未来需结合光遗传/电生理及雌鼠对照研究。

结论(翻译)

本研究首次提供了PMv^LepRb神经元全面的单突触全脑输入-输出图谱。数据显示这些神经元整合编码代谢、社会、情绪及生殖状态的多样化输入；进而既对其上游传入区施加反馈调节，又向脑干发出强兴奋性能量投射。该连接图谱为阐明大脑如何将内部代谢状态耦合至生存相关的本能行为提供了关键解剖学基础。