LRP1的配体偏好受O-连接糖链（O-glycan）调控——由多肽N-乙酰半乳糖胺转移酶11（GALNT11）启动的连接区O-糖基化修饰决定配体选择性

《SCIENCE ADVANCES》：The ligand preference of LRP1 is regulated by O-glycans

　　

低密度脂蛋白受体（Low-density lipoprotein receptor, LDLR）家族及LDLR相关蛋白（LDLR-related proteins, LRPs）是内吞受体，作为胆固醇清除、蛋白质重吸收和神经元蛋白转运等关键生理过程的重要调节因子发挥作用。LRP配体结合结构域（ligand-binding domains）间的连接肽（linkers）上存在位点特异性O-糖链（O-glycans），这些连接区O-糖链主要由20种多肽N-乙酰半乳糖胺转移酶（polypeptide GalNAc-transferase, GALNT）同工酶中唯一的GALNT11启动合成。本研究探讨GALNT11介导的连接区O-糖链在广泛表达的多配体大受体LRP1中的功能。研究人员在表达含或不含GALNT11的LRP1的细胞模型中证明，RAP（receptor-associated protein）和载脂蛋白E（apolipoprotein E, ApoE）等部分配体的摄取不受影响，而神经毒性tau蛋白和β-淀粉样蛋白（amyloid-β, Aβ）的摄取发生改变且呈相反方向。对LRP1连接区O-糖链的特征分析表明其唾液酸（sialic acid）封端不完全，分子动力学（molecular dynamics, MD）模拟显示这一特征使其可发生分子间及分子内相互作用。研究结果表明内吞受体存在潜在的调控机制，并证实LRP1的配体谱受O-糖链影响，对神经退行性疾病具有启示意义。

研究背景与意义

低密度脂蛋白受体（Low-density lipoprotein receptor, LDLR）家族及LDLR相关蛋白（LRPs）是I型跨膜内吞受体，参与胆固醇清除、尿蛋白重吸收及血-脑脊液屏障（blood-CSF barrier）和血-脑屏障（blood-brain barrier, BBB）处神经元及脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）蛋白的转运（transcytosis）。LRP1（LDLR-related protein 1）是该家族中分子量大（>600 kDa）、配体谱广（>50种配体）且脑、肝高表达的成员，可内吞α₂-巨球蛋白（alpha₂-macroglobulin, A2M）、载脂蛋白E（apolipoprotein E, ApoE）、β-淀粉样蛋白（amyloid-β, Aβ_{1–40/1–42}）及微管相关蛋白tau，与阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）等tau蛋白病（tauopathy）和淀粉样变密切相关。既往研究发现LRP配体结合结构域——富含半胱氨酸的低密度脂蛋白受体A类重复序列（LDLR class A cysteine-rich complement type repeats, CRs）之间的短连接肽（linkers）常含有保守的C₆X(3–5)T*C₁基序（Thr为O-糖基化位点），该位点专一性由GALNT11（polypeptide GalNAc-transferase 11）启动O-GalNAc糖基化，但其对LRP1广谱配体识别与选择性内吞的具体调控作用及分子机制尚不清楚。本研究旨在明确GALNT11介导的连接区O-糖链是否及如何调控LRP1的配体偏好与内吞功能，并探讨其对神经退行性疾病相关配体（tau、Aβ、血红素结合珠蛋白hemopexin, HPX）代谢的影响。

主要关键技术方法

研究人员构建两组HEK293细胞LRP1稳定表达模型——CRISPR-Cas9介导的内源性LRP1基因启动子激活（LRP1^Act）和全长LRP1-cDNA重组稳定转染（LRP1^Rec），并通过CRISPR-Cas9敲除GALNT11获得同基因对照（LRP1^ΔT11）；以SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞系及其GALNT11 KO克隆验证脑相关细胞中的表型；制备可溶性LRP1胞外段（sLRP1）及GALNT11 KO对照，经链霉亲和素亲和层析及凝胶过滤纯化后进行O-糖链释放与液相色谱-质谱（LC-MS）糖谱分析；利用流式细胞术定量荧光标记配体（A2M、RAP、ApoE、tau各亚型、Aβ_{1–40/1–42}、HPX:heme复合物）的LRP1依赖性细胞摄取，并以未标记RAP竞争性抑制确认LRP1特异性；建立基于长链生物素（LC-biotin）标记人CSF蛋白、TMTsixplex标记肽段、NeutrAvidin富集结合LC-MS/MS的非偏向性CSF配体筛选平台鉴定受GALNT11 O-糖基化影响的LRP1配体；通过分子动力学（MD）模拟比较CR5-CR6连接肽Thr⁴⁴位无唾液酸core1 O-糖链与单唾液酸化core1 O-糖链对CR-RAP界面相互作用的影响；采用C57BL/6NRj背景Galnt11^?/?小鼠全脑裂解液进行Jacalin凝集素印迹验证体内保守性。样本来源包括人pooled CSF（来自哥本哈根大学医院创伤中心腰穿阴性的匿名标本）及8～12周龄同窝野生型与Galnt11^?/?小鼠。

研究结果

O-glycans in CR linkers of LRP1（LRP1 CR连接区的O-糖链）

检索已发表O-糖蛋白质组数据库（glyco.me），确认LRP1 27个CR连接区中有13个位点存在实验验证的O-糖链，其中8个符合C₆X(3–5)T*C₁基序且仅在GALNT11存在时被糖基化，CR cluster II连接区O-糖基化频率最高，这些位点在脊椎动物中高度保守。

O-glycosylation does not affect secretion of LRP1（O-糖基化不影响LRP1的分泌）

Western blot及流式细胞术显示GALNT11 KO不改变LRP1细胞表面表达量、亚细胞定位及α/β亚基完整性；Jacalin凝集素印迹证实LRP1上O-糖链特异地依赖GALNT11；Galnt11^?/?小鼠脑组织中Lrp1蛋白量不变但Jacalin结合显著下降，与细胞模型一致。

GALNT11-mediated O-glycosylation modulates LRP1 ligand specificity and uptake（GALNT11介导的O-糖基化调控LRP1配体特异性和摄取）

流式细胞术配体内吞实验显示：A2M、RAP、ApoE2/3/4的摄取不受GALNT11 KO影响；tau（包括超磷酸化tau-Sf9及磷酸模拟突变体tau-3xKQ、tau-9xKQ）在GALNT11 KO细胞中摄取降低约20%～25%（磷酸化程度越高降幅越大）；Aβ_1–40和Aβ_1–42在GALNT11 KO细胞中摄取增加约25%～30%；SH-SY5Y^WT与SH-SY5Y^ΔT11细胞中重现相同趋势——tau摄取降约20%，Aβ_1–42摄取升约25%，RAP不受影响。表明GALNT11启动的O-糖链选择性增强tau内吞、抑制Aβ内吞。

Discovery of LRP1 ligands in CSF affected by GALNT11-mediated O-glycosylation（发现受GALNT11 O-糖基化影响的CSF中LRP1配体）

LC-biotin标记人CSF蛋白摄取结合TMT标记LC-MS/MS筛选，鉴定出15个LRP1依赖内吞的CSF蛋白（含潜在新配体CD14、ISLR、MDH1）；对比LRP1^Act与LRP1^Act-ΔT11，7个蛋白摄取受GALNT11影响，其中A2M摄取略降，血红素结合珠蛋白（hemopexin, HPX）摄取降幅最大（约40%），荧光标记HPX:heme复合物摄取验证降低约20%，确认HPX为受连接区O-糖链促进摄取的LRP1配体。

O-glycans on LRP1 are selectively hyposialylated（LRP1上的O-糖链呈选择性低唾液酸化）

纯化的sLRP1 O-糖链LC-MS糖谱分析显示最丰富为无唾液酸core1（T型，相对丰度约30%），其次为单唾液酸core1（mSTa/mSTb，共约35%）和双唾液酸core1（dST，约20%）及Tn（约9%）；GALNT11 KO后无唾液酸core1和Tn相对丰度降至约1/3，单/双唾液酸core1比例升高，说明CR连接区由GALNT11引入的O-糖链较其他位点低唾液酸化；未检测到分支core2 O-糖链；过表达ST3GAL1不能提高LRP1上O-糖链唾液酸化，提示连接区空间位阻或RAP伴随运输限制了后续唾液酸化。

Sialylation of linker O-glycans are predicted to obstruct inter- and intramolecular interactions（连接区O-糖链唾液酸化预期会阻碍分子间和分子内相互作用）

以CR5-CR6·RAPd1（PDB: 2fyl）为模板进行1 μs MD模拟：无唾液酸core1 O-糖链（Thr⁴⁴）可通过半乳糖基与CR6的Trp⁶³发生CH-π堆积，或与RAPd1的Glu²³/Glu³⁰形成氢键，使连接肽参与配体-受体界面相互作用；单唾液酸化core1因空间位阻无法发生上述堆积或氢键作用，连接肽保持溶剂暴露且不参与结合。表明不完全唾液酸化使连接区O-糖链能微调LRP1构象或配体接近性，从而差异化影响tau与Aβ等配体内吞。

讨论与结论翻译

本研究证明LRP1的配体谱受CR连接区GALNT11启动的O-糖链调控，该O-糖链选择性低唾液酸化且可通过非共价相互作用影响受体构象或配体结合界面。GALNT11缺失使tau（特别是高磷酸化tau）内吞减少、Aβ内吞增加，提示LRP1 O-糖基化异常可能削弱tau清除促其胞外传播，同时增强Aβ内吞致潜在胞内毒性，与神经退行性疾病病理相关联。研究还建立基于细胞的非偏向性CSF配体筛选平台，发现HPX等新型受O-糖基化影响的LRP1配体。综上所述，由GALNT11启动的连接区O-GalNAc糖基化是LDLR/LRP家族此前未被认识的调控模块，可通过修饰现存细胞表面受体快速响应生理信号，调节LRP1配体偏好及神经相关配体代谢，为理解内吞受体功能及神经退行性疾病机制提供了新视角。