低铁牛乳转铁蛋白（Low-Iron Bovine Lactoferrin, apo-bLf）对溶组织内阿米巴（Entamoeba histolytica）滋养体黏附、红细胞吞噬、细胞毒性及蛋白水解活性的影响

《International Journal of Molecular Sciences》：Low-Iron Bovine Lactoferrin Affects Adhesion, Erythrophagocytosis, Cytotoxicity, and Proteolytic Activity in Entamoeba histolytica Trophozoites

　　

摘要：溶组织内阿米巴（Entamoeba histolytica）建立感染须借助多种致病机制，产生并分泌毒力因子，使寄生虫得以黏附并最终定植及侵入宿主。然而，在肠上皮处，滋养体（阿米巴）会遇到转铁蛋白（Lactoferrin, Lf）——一种与免疫球蛋白及其他分子共同构成第一道防线的糖蛋白。研究人员此前报道，无铁牛Lf（bovine Lf, bLf）在体外及肠道与肝脏阿米巴病动物模型中均可杀死阿米巴。本研究将亚致死浓度bLf作用于培养的滋养体，评估选定的致病机制受何影响，以确定阿米巴哪些功能可被改变。在亚致死bLf浓度下，该糖蛋白可从滋养体表面被移除。存在红细胞时，共聚焦显微镜观察活细胞可见bLf与红细胞在帽状结构（capping site）共定位。此外，bLf存在时，红细胞吞噬率、蛋白水解活性、对Caco-2结肠癌细胞系的黏附及细胞毒性均降低。转铁蛋白可能是一种可天然保护结肠上皮细胞免受E. histolytica感染的重要蛋白质。

研究背景与意义

溶组织内阿米巴（Entamoeba histolytica，简称Eh）感染全球约10%人口，每年致4万～10万人死亡，是儿童肠道感染相关死亡的第二大原因。其致病依赖四大关键毒力机制：经Gal/GalNAc凝集素介导的宿主细胞黏附、半胱氨酸蛋白酶（Cysteine Proteases, CPs）降解黏液与细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）、接触依赖性细胞毒性（阿米巴穿孔素Amoebapores与啃食Trogocytosis）及红细胞吞噬（Erythrophagocytosis）。肠黏膜先天免疫分子——转铁蛋白（Lactoferrin, Lf），尤其是低铁（脱铁，apolactoferrin, apo-Lf，铁饱和度0–5%）形式，先前已被研究人员证实可在体外及肝脓肿仓鼠模型、肠道感染小鼠模型中杀灭Eh滋养体，且与抗阿米巴药甲硝唑（Metronidazole）有协同作用；而富铁（全铁，holo-Lf，铁饱和度>95%）bLf可被阿米巴内吞作为铁源。但apo-bLf在亚致死浓度下如何具体干扰Eh各毒力表型及其与膜相互作用的机制尚不清楚。该研究旨在明确低铁牛乳转铁蛋白（bLf）对Eh滋养体黏附、红细胞吞噬、细胞毒性及蛋白酶分泌的影响，为Lf作为辅助抗阿米巴制剂提供依据。论文发表于《International Journal of Molecular Sciences》。

主要关键技术方法

研究人员将Eh滋养体于Chelex-100树脂处理去除游离铁的低铁BI-S-33培养基中预培养24 h，分别以12.5 μM亚致死低铁bLf（铁饱和度14.1%，apo-bLf）和同等浓度富铁holo-bLf为处理/对照。采用MTT法测定不同bLf浓度下滋养体存活率以确定亚致死浓度；以固定Caco-2细胞单层和差减法计数评估黏附率；FITC标记bLf/holo-bLf共聚焦激光显微镜观察活/固定滋养体膜结合与内化/排出动态；与人O型Rh?红细胞共孵育后测血红蛋白吸光度定量红细胞吞噬量并共聚焦观察共定位；Caco-2活细胞共培养甲基蓝染色法测细胞单层存活率评价细胞毒性；Western blot以兔抗bLf血清检测阿米巴总蛋白提取物对bLf的降解及蛋白酶抑制剂分型；明胶/ bLf共聚SDS-PAGE进行酶谱（Zymography）分析培养上清（Supernatant, SN）分泌性蛋白酶活性；偶氮胶原（Azocoll）显色法定量SN蛋白酶活力。

研究结果

2.1. Effect of bLf on the Viability of Trophozoites of Entamoeba histolytica

以3.125–100 μM bLf处理Eh滋养体24 h，MTT法检测发现6.25 μM及以下对存活无显著影响，25 μM时存活率约77%，50–100 μM存活率不低于27%。选定12.5 μM（存活率约88%）作为后续实验亚致死浓度。

2.2. Adhesion to Caco2 Cells

预孵育12.5 μM bLf的滋养体与甲醛固定Caco-2单层共孵育30 min，计数非黏附虫体。结果表明bLf处理组黏附率降至约50%（对照组及holo-bLf组分别接近100%和79.5%），说明低铁bLf显著抑制Eh对结肠上皮细胞的黏附。

2.3. Confocal Microscopy of Trophozoites Incubated with bLf

FITC-bLf与FITC-holo-bLf分别孵育滋养体，活细胞共聚焦观察显示：5 min时bLf沿质膜呈斑块状分布，15 min时斑块聚集并于细胞一极释放至胞外，bLf不被内吞；而holo-bLf 5 min即开始被内吞，15 min见于胞质囊泡。说明apo-bLf结合Eh质膜后被帽化（capping）并排出，不同于holo-bLf的内吞利用。

2.4. The Effect of bLf on erythrophagocytosis

预孵bLf的滋养体与人红细胞共孵，共聚焦见bLf与聚集于虫体后极（uroid区）的红细胞共定位，且bLf随后与帽结构一同脱落；血红蛋白定量显示bLf处理组平均吞噬红细胞数约14.4个/虫体，较未处理组（24.3个/虫体）下降约56%，holo-bLf仅抑制约25%。表明低铁bLf明显削弱Eh红细胞吞噬能力。

2.5. Cytotoxicity to Caco2 Cells

Caco-2活细胞单层与预孵bLf或holo-bLf的滋养体共孵1 h，甲基蓝染色测660 nm吸光度。bLf处理组Caco-2细胞存活率高于未处理阿米巴感染组约20%，holo-bLf组保护作用弱。提示低铁bLf可部分降低Eh对结肠上皮的接触依赖性细胞毒性。

2.6. Lactoferrin Degradation by Entamoeba histolytica Proteases

Western blot显示阿米巴总蛋白提取物可在5 min起降解bLf/holo-bLf，且降解可被半胱氨酸蛋白酶特异性抑制剂E-64阻断，确认属CPs作用；但bLf预处理滋养体所收集的培养上清SN不能降解bLf。说明胞内/总提取CPs保有活性，但分泌至上清的CPs在bLf存在时表现无（或极低）降解力。

2.7. Amoebic Proteolytic Activity Assessed by Zymography and Azocoll Cleavage

明胶-酶谱分析显示，未加bLf的低铁培养SN可检出清晰蛋白水解带，而bLf或holo-bLf处理组SN即使上样量加大亦无降解条带；Azocoll显色定量显示bLf处理组SN蛋白酶活性降至低铁对照的约63.6%，加CP抑制剂p-羟基汞苯甲酸（PHMB）则完全抑制。表明低铁bLf可抑制Eh分泌性CPs的胞外活性，可能是bLf直接与CPs活性位点结合或干扰其分泌/多酶复合物稳定性。

讨论与结论总结

讨论指出，Eh滋养体入侵肠道首先遭遇含Lf的黏膜屏障；低铁bLf不被内吞而结合质膜→帽化排出→使膜上Gal/GalNAc凝集素等毒力相关蛋白随帽丢失或重分布，从而削弱黏附与红细胞吞噬所需的细胞骨架重组；红细胞吞噬减弱与bLf-红细胞共定位于uroid及帽化排出有关。holo-bLf因被内吞供铁，对黏附与吞噬抑制较弱。bLf对Caco-2细胞毒性的部分抑制源于黏附受损，但阿米巴尚有阿米巴穿孔素、CPs分泌及啃食等非黏附依赖杀伤途径，故毒性未完全消除。CPs方面，胞内CPs仍可降bLf，但分泌至上清者活性被bLf抑制，酶谱无条带、Azocoll活性降约37%，推测bLf结合CPs活性中心或破坏多蛋白CPs复合物。综上，低铁bLf通过膜组分重排抑制黏附与红细胞吞噬，并抑制分泌性CPs活性，弱化Eh毒力。

文末研究结论翻译如下：

综上所述，尽管溶组织内阿米巴可通过半胱氨酸蛋白酶降解牛乳转铁蛋白（bLf），但亚致死浓度bLf与滋养体的初始相互作用会触发膜组分的大规模重分布，降低寄生虫黏附及摄入宿主细胞的能力，这为理解Lf如何参与阿米巴病的早期控制提供了新视角。低铁bLf的作用可归纳为：（1）bLf通过螯合生存所需铁抑制寄生虫生长；（2）亚致死浓度bLf诱导红细胞在寄生虫某一区域聚集；（3）bLf结合寄生虫质膜并随后被排出至胞外培养基，影响膜蛋白组成；（4）膜结构及其特性关联阿米巴毒力与侵袭能力，影响膜功能——主要是黏附与吞噬；（5）分泌至上清的蛋白酶活性可因bLf直接与蛋白酶结合而受影响。牛乳转铁蛋白通过重塑溶组织内阿米巴膜组分及抑制黏附和红细胞吞噬削弱其毒力；膜脂质和/或蛋白质的重分布可阻止寄生虫摄入宿主细胞。不过，仍需进一步研究以全面阐明bLf对溶组织内阿米巴滋养体的具体作用机制。