Lysobacter capsici XL1来源细菌溶解性蛋白酶Blp与金黄色葡萄球菌209P细胞壁相互作用的特性

《International Journal of Molecular Sciences》：Peculiarities of the Interaction of the Bacteriolytic Protease Blp from Lysobacter capsici XL1 with the Cell Wall of Staphylococcus aureus 209P

　　

Lysobacter capsici XL1的β-裂解蛋白酶（Blp）是一种细菌溶解酶，能够水解革兰氏阳性菌肽聚糖（peptidoglycan）中肽间桥（interpeptide bridge）的肽键，包括致病菌耐药菌株中的相应结构。关于Blp的性质已开展了较为系统的研究，尚未阐明的唯一方面是该酶识别靶细胞的机制。本研究首次证实，Blp的结构中存在一个可能负责该相互作用的C末端亚结构域。分子模拟提示，Blp与肽聚糖之间的相互作用具有疏水性特征。所构建的Blp模型突变体在C末端亚结构域中具有较少的疏水区域，同时也具有较少的与配体发生潜在相互作用的位点。湿实验结果表明，这些Blp突变体与肽聚糖及活体金黄色葡萄球菌209P细胞的结合能力减弱，进而导致细菌溶解活性与蛋白水解活性下降。研究鉴定出C末端亚结构域中的氨基酸残基N136和Y160，其可能对酶与靶细胞之间的相互作用具有重要意义。进一步阐明细菌性细菌溶解蛋白酶识别靶细胞的机制，将有助于利用这一认识拓展此类酶的作用特异性，并推动其作为医学应用抗菌剂（antimicrobial agents）的开发。

该论文发表于《International Journal of Molecular Sciences》，聚焦于革兰氏阴性菌来源胞外细菌溶解性蛋白酶（bacteriolytic protease）如何识别并结合靶细胞表面这一关键但长期未解的问题。研究对象为Lysobacter capsici XL1产生的β-裂解蛋白酶Blp。既往研究已较充分揭示Blp的生化性质、空间结构、底物切割特征以及对多种革兰氏阳性菌，尤其是金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抗菌活性，但其与靶细胞表面发生初始接触和识别的分子基础仍不清楚。相较于革兰氏阳性菌来源的相关酶常具有“催化结构域+底物结合结构域”的双结构域组织形式，革兰氏阴性菌来源胞外M23家族蛋白酶多呈单结构域构型，因此其如何实现底物识别具有重要理论意义，也关系到此类酶作为新型抗菌分子的工程化改造潜力。基于已知同属M23A家族的pseudoalterin存在参与肽聚糖糖链结合的区域，研究人员提出假设：Blp结构中可能也存在承担初始识别功能的局部亚结构域。本研究的核心目标即是鉴定这一结构区域，并解析其与靶细胞肽聚糖相互作用的性质及功能后果。

为实现上述目标，研究人员综合采用了结构叠合分析、分子动力学模拟（MD）、水自由能表面分析、定点突变、同源表达、蛋白纯化、圆二色谱（CD）、荧光热变性、底物结合实验以及细菌溶解/蛋白水解活性测定等方法。样本来源主要包括L. capsici XL1及其构建的Δblp突变株表达系统，以及活体S. aureus 209P细胞和其分离的肽聚糖。方法上重点通过野生型与突变型Blp的比较，建立“结构特征—结合能力—酶学活性”之间的对应关系。

2.1. Identification of a Possible Binding Site for Bacterial Peptidoglycan in the Structure of the Bacteriolytic Protease Blp
研究人员首先将Blp与pseudoalterin进行结构叠合，确认两者具有同源性，并在Blp中识别出由N136–R167氨基酸残基构成的区段，该区段由4条反向平行β链组成，在空间上对应于pseudoalterin中已知参与肽聚糖结合的C末端亚结构域。进一步构建蛋白表面疏水性/亲水性图谱，并以肽聚糖糖链片段（NAG–NAM）₂作为配体进行MD模拟。结果显示，Blp表面存在两处相对低亲水性区域，一处位于催化沟槽，另一处位于C末端亚结构域。配体主要与该C末端亚结构域接触，但未形成单一稳定构象，而是表现出较强柔性。配体的乙酰胺基优先分布于由N136、Y139、R144、T146、T148、Y160、T162、N164围成的袋状区域，且未观察到显著氢键网络或盐桥网络，因此研究人员据此提出：Blp与（NAG–NAM）₂的结合主要体现为疏水性相互作用。基于模拟结果，又选取R144、N136和Y160进行点突变建模。结果显示，R144A突变使潜在结合位点的疏水表面积增加29%，N136R和Y160R则分别降低17%和14%；N136A和Y160A对整体疏水性轮廓影响不明显。由此提出推论：R144A可能增强Blp对肽聚糖的亲和性，而N136R和Y160R可能削弱这种结合。

2.2. Production of Mutant Forms of the Blp Bacteriolytic Protease
为验证模拟结论，研究人员通过定点突变构建了blp基因的多个突变体，并将表达质粒导入L. capsici XL1Δblp同源表达宿主中，获得野生型Blp及Y160A、Y160R、R144A、N136A、N136R等突变蛋白的表达菌株。随后从培养上清中纯化得到均一的目标蛋白。为评估点突变是否改变蛋白总体构象，研究人员采用CD和荧光法进行分析。远紫外CD谱显示，所有蛋白的谱形几乎一致，均符合富含β折叠的结构特征；二级结构定量结果亦表明反向平行β折叠比例变化较小，说明这些突变并未显著破坏天然蛋白的二级结构。荧光热变性实验显示，各突变体仍呈现合作性熔解曲线，提示其疏水核心仍保持致密堆积；但其熔解温度均较野生型下降6.6–14.6 °C，说明氨基酸替换降低了蛋白稳定性。综合来看，这些突变未根本改变Blp的空间结构，但会造成一定程度的稳定性下降，因此后续结合能力和酶活变化更可能与局部表面理化性质改变有关，而非整体折叠破坏所致。

2.3. Effect of Mutations on the Bacteriolytic and Proteolytic Activities of the Blp Protease
研究人员分别以活体S. aureus 209P细胞和酪蛋白（casein）作为底物，测定Blp各突变体的细菌溶解活性与蛋白水解活性。结果表明，Y160R突变使细菌溶解活性下降约4倍，蛋白水解活性下降约2倍；N136R突变使两种活性分别下降约5倍和2倍。相比之下，Y160A和N136A突变对上述活性无明显影响。R144A则使细菌溶解活性提高约1.7倍，蛋白水解活性提高约1.5倍。该结果与前述分子模拟对于局部疏水表面变化的预测总体一致，即当突变引入更亲水且空间占据更大的精氨酸（arginine）后，酶活下降；而当R144被丙氨酸（alanine）替代后，局部口袋空间扩展并伴随疏水面积增加，酶活相应增强。由于蛋白整体结构未被明显破坏，这些活性变化支持C末端亚结构域参与底物识别并影响催化前结合阶段。

2.4. Effect of Mutations on the Binding of the Blp to Living Cells and S. aureus 209P Peptidoglycan
随后，研究人员直接检测突变对Blp与活体S. aureus 209P细胞及其肽聚糖结合能力的影响。结果发现，Y160R和N136R分别使其与S. aureus 209P肽聚糖的结合能力降低1.4倍和1.6倍，与活菌细胞的结合能力降低2.7倍和2.1倍。Y160A、N136A和R144A则未表现出显著结合能力下降。该结果与酶活测定结果相互印证，说明Y160和N136位于Blp C末端亚结构域中，对酶与靶细胞表面糖组分的有效结合具有重要作用。研究据此确认，Blp中确实存在一个参与靶细胞初始识别的C末端亚结构域，其中N136和Y160是关键功能残基。

讨论部分围绕革兰氏阴性菌胞外细菌溶解性蛋白酶的识别机制展开。研究人员指出，革兰氏阳性菌相关酶如lysostaphin已明确具有独立底物结合结构域，例如SH3b结构域，可识别金黄色葡萄球菌肽聚糖中的五甘氨酸桥和肽干。而革兰氏阴性菌来源同类酶普遍缺乏这种经典双结构域架构，因此其识别位点应当以内嵌于单结构域内部的局部亚结构形式存在。对于pseudoalterin，先前研究已定位到N134–R173区域参与肽聚糖结合，但该研究将其解释为独立C结构域。本文作者基于与LasA和Blp的结构比较，认为将其界定为C末端亚结构域更为准确。基于这一认识，本研究在Blp中定位到同源区域N136–R167，并通过MD和实验双重证据证明该区域参与配体结合。尤其重要的是，研究结果提示Blp与肽聚糖的相互作用主要不是通过稳定的氢键网络介导，而更可能依赖局部低亲水性袋状表面形成的疏水效应。这一点与pseudoalterin中报道的以氢键为主的结合模式并不相同，也说明不同革兰氏阴性菌来源M23家族胞外蛋白酶在识别机制上可能存在差异。作者进一步强调，同源表达系统的建立对获得正确折叠的突变蛋白至关重要，从而保证了不同突变体之间功能比较的可靠性。

本研究的重要意义在于，首次在L. capsici XL1来源Blp中鉴定出一个与靶细胞肽聚糖初始结合相关的C末端亚结构域，并指出N136和Y160是其中具有功能重要性的氨基酸残基。该发现不仅推进了对革兰氏阴性菌胞外细菌溶解性蛋白酶识别机制的理解，也为后续通过理性设计调整其底物特异性、扩大抗菌谱以及开发医学抗菌制剂提供了结构基础。由于Blp本身具有较广的抗菌和蛋白水解谱，对其识别机制的解析还可能促进此类酶在抗耐药菌策略中的应用探索。

研究结论部分可概括为：Blp的空间结构中存在一个C末端亚结构域，该亚结构域可能参与酶与靶细胞肽聚糖的初始结合，并且这种相互作用很可能主要由疏水性作用驱动。该亚结构域中的N136和Y160残基可能在结合过程中发挥重要作用。与此同时，研究人员也指出，仍需在更多革兰氏阴性菌来源细菌溶解性蛋白酶中积累实验数据，以判断这是否代表一类普遍机制，还是不同酶具有各自特异的靶细胞识别方式。