《International Journal of Molecular Sciences》：Predicting Response to Immune Checkpoint Inhibitors in Melanoma: Emerging Approaches in Digital Pathology, Spatial Profiling and Machine Learning
将免疫检查点抑制剂（ICIs）引入黑色素瘤治疗在过去十年中显著降低了死亡率。然而，并非所有患者均能观察到治疗获益，且治疗可能伴随严重不良事件。因此，识别最可能从免疫治疗中获益的患者仍至关重要。目前使用的生物标志物，如程序性死亡配体1（PD-L1）表达和肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的手工评估，预测价值有限。本叙述性综述对采用数字病理学工具、多重和空间技术（包括多重免疫荧光、成像质谱流式细胞术和数字空间分析）以及机器学习算法预测黑色素瘤患者对ICIs反应的研究进行了批判性评估。现有证据表明，整合免疫浸润定量评估与其在肿瘤微环境中的空间分布、功能状态和相互作用信息的方法可能达到最高的预测价值。与“免疫炎症型”、“免疫排除型”和“免疫荒漠型”表型、三级淋巴结构的存在以及局部免疫微环境的组织相关的特征可能尤其重要。此外，本综述强调了当前数据解读中的关键局限性，包括缺乏方法学标准化、数据异质性和验证不足。还讨论了将这些方法应用于常规临床实践所需的未来研究方向。
1. Introduction
1.1. Melanoma as a Global Health Problem
黑色素瘤是一种起源于表皮基底层黑素细胞的恶性肿瘤，约占所有皮肤癌的1%，但由于其高转移潜能和对传统治疗方式的抵抗，导致近80%的皮肤癌相关死亡。其发病率持续上升，预计到2040年全球发病率将比2020年增加约50%，每年新增近50万例。这一趋势与人口老龄化、紫外线辐射暴露增加以及诊断活动增强（包括过度诊断现象）相关。尽管存在这些因素，黑色素瘤的全球健康负担仍然巨大。
1.2. Immunological Determinants of Response to ICIs
免疫检查点抑制剂（ICIs），包括抗程序性细胞死亡蛋白1（anti-PD-1）、抗细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（anti-CTLA-4）和抗淋巴细胞活化基因3（anti-LAG-3）抗体，以及靶向治疗，已使美国黑色素瘤死亡率在2013-2017年间每年下降近6%，随后在2017-2023年间每年再下降1.2%。然而，治疗效果取决于肿瘤免疫表型，鉴于严重不良事件的风险，适当的患者选择至关重要。肿瘤微环境（TME）的免疫表型反映肿瘤、免疫和基质细胞的状态，其相互作用决定对ICIs的反应。细胞毒性CD8
+ T淋巴细胞发挥核心作用，高浸润水平通常与改善的预后相关。基于免疫细胞的分布和活性，区分出三种主要表型：免疫炎症型（“热”肿瘤），其特征是肿瘤实质内丰富的T细胞浸润、干扰素-γ（IFN-γ）通路激活、程序性死亡配体1（PD-L1）表达增加和肿瘤突变负荷（TMB）升高，通常对ICIs反应更好。B细胞和三级淋巴结构（TLSs）可能有助于形成“热”免疫微环境并与改善的治疗反应相关。免疫排除型表现为免疫细胞存在于肿瘤周围基质中而未有效浸润肿瘤核心，与转化生长因子β（TGF-β）信号传导依赖的肿瘤基质活性增加、癌症相关成纤维细胞（CAFs）促进纤维化和细胞外基质重塑相关，导致淋巴细胞滞留于肿瘤周围基质，此类患者对ICI单药治疗反应有限。免疫荒漠型（“冷”）肿瘤缺乏有效启动和最小T细胞浸润，通常具有低TMB、主要组织相容性复合体I类（MHC I）分子和PD-L1表达降低、抗原呈递受损以及免疫抑制机制（包括调节性T细胞（Tregs）、髓源性抑制细胞（MDSCs）和肿瘤相关巨噬细胞）占优势，一般对ICIs反应差。
1.3. Why Are Standard Histopathological Techniques Insufficient for Predicting Response to ICIs?
常规组织病理学评估主要提供分期和预后信息，但在预测ICI治疗反应方面作用有限。标准参数（如原发性肿瘤特征、区域淋巴结受累或远处转移）主要具有预后意义，不能完全反映决定免疫治疗疗效的TME复杂性。肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）是免疫反应中最常分析的指标之一，主要在苏木精和伊红（H&E）染色切片及免疫组织化学（IHC）中评估。然而，手动TIL评估存在主观性和观察者间变异，且不能完全捕捉肿瘤细胞、免疫细胞与基质之间的空间关系。单个生物标志物（如PD-L1）的测量由于预测价值有限和表达动态变化，不能为ICI治疗提供足够精确的患者选择。因此，数字和空间病理学工具越来越重要，能够实现更客观、定量和多维度的TME表征。
2. Literature Review
本文为一篇叙述性综述，通过PubMed和Google Scholar数据库检索，重点涵盖2019年1月1日至2026年4月1日期间同行评审的英文出版物，主要关注关于新预测性生物标志物、整合成像和空间数据的方法以及影响这些方法临床实施的方法学局限性。检索关键词包括“黑色素瘤”、“肿瘤微环境”、“肿瘤浸润淋巴细胞”、“数字病理学”、“机器学习”、“多重方法”、“数字空间分析”、“免疫组织化学”、“免疫检查点抑制剂”和“反应预测因子”。主要纳入评估组织学标志物、H&E图像分析、IHC、多重技术、空间分析和机器学习模型的原始研究，同时纳入部分综述文章提供生物学背景。排除非同行评审出版物、仅摘要、非英文、非黑色素瘤研究以及缺乏ICI反应预测或数字病理学相关数据的文章。选择过程基于主题相关性、方法学质量和主题重要性，在不确定时作者讨论并达成共识决定。
3. Digital Pathology and Spatial Profiling of TME
3.1. Quantitative Assessment of TILs and Other Immune Infiltrates in Digital Images
基于数字图像对免疫浸润进行定量评估是预测黑色素瘤ICI反应最有前景且实用的工具之一。通常基于H&E或IHC染色切片的全切片图像（WSIs），使用机器学习算法自动量化TILs。多项研究一致表明，数字评估的淋巴细胞浸润水平越高，抗PD-1治疗反应越好。例如，低电子肿瘤浸润淋巴细胞评分（eTILs）可能与未经全身治疗的转移性黑色素瘤患者疗效较差相关；人工智能（AI）算法评估的TILs百分比与治疗反应的相关性比手动评估更显著；通过CD8染色在全切片图像上测量的绝对T细胞密度也具有预测意义。此外，对肿瘤浸润免疫细胞（TIICs）的广泛分析显示，CD8
+细胞浸润更高与ICI反应显著相关，PD-L1阳性细胞浸润更高和CD1a阳性细胞浸润更低也是如此。这些结果表明，数字玻片分析的预测价值不仅取决于免疫细胞数量，还取决于其类型和TME内的组织。
3.2. Spatial Profiling of the Tumour Microenvironment
3.2.1. Spatial Proteomics
越来越多的研究集中于整合TME分析，而非单一标志物评估。定量免疫荧光（QIF）和多重免疫荧光（mIF）结合机器学习可同时评估免疫浸润的细胞组成、定位和空间关系。早期研究显示定量浸润具有预测价值，如QIF测定的CD4、CD8和CD20蛋白计数与抗PD-1治疗反应正相关，尤其CD8淋巴细胞。mIF表明反应与免疫细胞靠近肿瘤细胞相关。后续研究强调整合这些参数与空间信息可能比单一分子特征更具预测价值。一项结合mIF和机器学习的研究显示，单独TILs、TME细胞组成或一氧化氮合酶水平均不能预测抗PD-1反应，最佳结果在综合所有参数时获得，尤其是在免疫细胞丰富区域，反应患者的TIL微环境中富含CD8、LAG-3、PD-L1和SOX10。诱导型一氧化氮合酶（iNOS）更高表达与更好反应相关，但存在样本量小（n=12）的限制。B细胞和TLS的作用也受到关注：使用mIF和空间聚类算法显示，肿瘤基质中B细胞百分比更高以及定量定义的B细胞聚集体存在与ICI反应相关，而病理学家的定性评估不相关。CD8
+T细胞与常规1型树突状细胞（cDC1s）之间更近的距离和更频繁的相互作用与更好治疗结局相关，而CD8
+T细胞数量单独无此关系。成像质谱流式细胞术（IMC）可同时评估多种标志物及其空间分布。一项研究识别出六种不同的TME原型，其中免疫热原型反应率最高，但反应者在生物学上并非同质；免疫冷原型（包括肿瘤细胞优势、缺氧或抑制性髓系细胞变异）反应率低。另一项IMC研究显示反应患者肿瘤含有更多单核细胞源性巨噬细胞（MDMs）和细胞毒性T细胞亚群，而无反应者常显示抑制性M2型巨噬细胞与T淋巴细胞共定位，并伴有CXCL9和CXCL10趋化因子mRNA水平升高。数字空间分析（DSP）使用GeoMx平台选择组织切片中的感兴趣区域（ROIs）进行高参数蛋白或RNA读取。研究表明，最强的ICI获益预测标志物是CD68
+细胞中的PD-L1表达，而非肿瘤细胞；基质中高PD-L1表达与更好反应相关，而特定肿瘤区室中的CD95表达和CD68表达与治疗抵抗相关。
3.2.2. Spatial Transcriptomics and Multimodal Profiling
空间转录组学方法（如数字空间分析全转录组图谱，DSP-WTA）可在保持空间背景的同时评估基因表达。一项研究识别了区室特异性基因特征，其预测治疗反应比批量RNA-seq特征更准确，八基因S100B特征表现最佳。单细胞和空间多组学研究表明，具有间充质样表型的黑色素瘤细胞在ICI抵抗患者中富集，其转录程序受TCF4调控。空间多组学整合单细胞数据（如CITE-seq）与高维组织成像平台（如PhenoCycler/CODEX），可同时评估细胞表型、转录组谱和空间组织。一项研究表明，抵抗肿瘤以“免疫奋斗型”TME为特征，具有肿瘤周围淋巴聚集和有限的T细胞向肿瘤核心浸润；而有利反应与富含B细胞特征的淋巴聚集相关，与早期研究一致。另一项结合空间和转录组学的研究显示，组织成TLS的B细胞存在与改善的临床结局相关，TLS基因标志可预测抗CTLA-4和抗PD-1治疗结局；富含B细胞的肿瘤中含有表达TCF7和IL7R的幼稚/记忆表型T细胞，而缺乏TLS的肿瘤则以更功能失调的T细胞表型为主。
3.3. Predictive Models Based on H&E Images Beyond Direct Assessment of TIL
应用深度学习模型分析常规H&E染色的黑色素瘤标本，可识别与炎症浸润、基质结构或肿瘤-基质相互作用相关的形态模式，并预测ICI治疗反应，无需直接手动TIL评估。几项独立研究显示，H&E图像的深度学习模型可提供临床相关的预测信息，AUC约为0.78-0.81。一项研究中，深度学习模型优于自动H&E基TIL评估（AUC 0.58），表明模型可能捕捉到简化TIL评估中未反映的额外形态特征。后续大规模研究证实，当分析限制于肿瘤组织更多的玻片并将图像预测与临床数据结合时，模型性能提高；有利治疗结局与上皮样形态、低肿瘤与基质比和更高TIL浸润相关。这些研究表明，H&E图像深度学习可能是更复杂TME评估方法的实用补充，得益于其广泛可用性和低成本，但需要进一步验证和标准化。
3.4. Predictive Features of the Tumour Microenvironment Across Different ICI Regimens
数字病理学和空间分析研究评估的预测因素应结合具体免疫治疗方案解读。针对抗PD-1治疗，有利结局与CD8
+TIL浸润增加、更高定量TIL评分、免疫细胞与肿瘤细胞更近的空间距离以及免疫热空间架构相关。关于抗CTLA-4单一治疗的数据较为有限，但TLS和B细胞相关特征与改善结局相关。结合抗PD-1/抗CTLA-4治疗的潜在生物标志物包括TIL浸润增加、低肿瘤与基质比、上皮样肿瘤形态以及具有B细胞特征的组织化淋巴聚集。关于抗LAG-3治疗的预测因素数据匮乏，目前一项mIF研究显示，抗PD-1治疗反应者中TIL相关微环境同时富含CD8、LAG-3、PD-L1和SOX10，提示LAG-3的预测价值可能取决于其与细胞毒性淋巴细胞浸润和免疫活性TME的共存。
4. Methodological Limitations and Confounding Factors
数字病理学和空间方法可能提供有前景的生物标志物，但预测价值本身并不决定临床实用性，还需考虑分析前和分析因素的可控性。这些限制适用于H&E或IHC基WSI分析以及更复杂的空间技术，额外的变异来源包括组织区室（如TLS和ROI）的定义方式。
4.1. Scanner Variability
WSI分析依赖数字扫描仪，不同扫描仪因分辨率、光学参数差异导致图像颜色特征不同，可能使AI模型在外部测试集上性能下降。多数研究硬件变化有限，但缺乏系统性鲁棒性测试，模型效果可能无法在具有其他设备的实验室中保持。物理颜色校准可能是解决方案。
4.2. Stain Variation in Slides
染色差异（包括强度、对比度和色调）可能影响H&E基模型的稳定性。一项非小细胞肺癌（NSCLC）研究显示，深度学习模型在一个批次上训练后在另一批次上丧失泛化能力。少数黑色素瘤研究使用染色归一化方法，但问题仍未完全解决。
4.3. Region of Interest Selection
ROI的选择是影响结果的关键因素，不同定义可能对同一患者得出不同结论。在定量TIL分析中，ROI常由经验丰富的病理学家手动划定；在DSP研究中，ROI定义和区室分割各不相同；在WSI深度学习方法中，玻片被分为数千个图块，选择程序差异可影响结果。标准化工具有待发展。
4.4. Heterogeneity of Treatment and Treatment Sequences
合并分析不同ICI方案（如抗PD-1、抗CTLA-4单药或联合免疫治疗）以及不同治疗线数的患者，可能增加队列大小但降低模型可解释性，模型可能部分捕捉治疗类型差异而非真正生物学决定因素。新治疗策略（如抗PD-1/抗LAG-3联合）的出现要求谨慎外推。治疗线和既往ICI暴露同样重要，因为TME免疫状态在初治和产生抵抗的患者中可能显著不同。
4.5. Material Collection Site and Sample Type
活检部位和标本类型（原发性肿瘤、淋巴结或软组织转移）可能是混杂因素，免疫微环境因病灶位置而异。一项研究显示，H&E基模型性能因活检部位和组织学肿瘤类型而异；另一研究将转移位置和标本类型直接纳入模型输入，显示各部位TIL比率不同。
4.6. Heterogeneous Timing of Tissue Collection Versus Treatment
组织收集与免疫治疗开始之间的时间间隔可能影响TME生物标志物评估，因为TME是动态的，可受既往治疗改变。多项基于回顾性队列的研究中，间隔时间中位数长达4个月，期间部分患者接受其他治疗，使生物标志物解释困难。可靠解释需要仔细控制技术和临床因素。
5. Complementary Biomarkers of Response to Immune Checkpoint Inhibitors
TMB（每兆碱基肿瘤DNA的突变数）在黑色素瘤中预测价值尚不确定，可能取决于亚型和炎症特征，与炎症特征联合时预测价值增加。IFN-γ特征和T细胞炎症基因表达谱（GEP）反映T细胞活化、IFN-γ产生和抗原呈递，与免疫治疗反应相关，但部分高IFN-γ特征患者仍表现抵抗。循环肿瘤DNA（ctDNA）通过液体活检评估，高或持续可检测水平与较差治疗反应相关，变化可监测疗效和早期复发，但尚未成为验证的预测性生物标志物。其他外周血生物标志物包括正常乳酸脱氢酶（LDH）水平和较低的中性粒细胞与淋巴细胞比率（NLR），以及CD8
+和CD4
+淋巴细胞细胞毒性活性增加，但某些免疫标志物（如sPD-1、sPD-L1）的意义尚不明确。这些标志物应视为互补而非替代。
6. Future Directions
未来研究设计应考虑ROI选择变异、治疗方案和序列异质性、标本采集部位以及活检至免疫治疗之间的时间间隔。在AI驱动的H&E图像分析中，需控制扫描仪和染色差异。模型的外部队列验证仍至关重要，需避免过拟合和协变量偏移。需要多中心国际研究，并设计前瞻性研究，预定义组织收集时间点和治疗线数。应注重数字病理学的转化和监管要求，模型需在性能、外部验证和合规性方面进行评估。大型患者队列的标准化空间分析可借助IMMUcan等联盟的工具，AI平台如Lunit SCOPE IO已在其他实体瘤中评估，为黑色素瘤研究提供基础。继续开发基于AI的H&E图像分析方法，因H&E染色可能包含更多生物学信息，成本更低，但不能替代高参数技术。单一标志物（如TIL计数）可能不足以独立预测，同时整合TIL评估、WSI数据和TME空间模型的综合方法可能更好地反映免疫治疗反应的生物学复杂性。
7. Clinical Translation and a Stepwise Implementation Workflow
目前数字病理学和空间分析不应被视为独立的ICI患者选择工具。逐步实施模型建议：第一步为AI辅助分析常规H&E和选定IHC染色，提供TILs、CD8
+细胞密度、肿瘤与基质比和免疫细胞空间分布的定量数据，作为病理学家和肿瘤学家的附加信息而非自主治疗建议。这需要适当的技术和组织基础设施（如WSI扫描仪、图像存储、软件验证和人员培训）。在选定的具有模糊H&E/IHC发现或怀疑复杂抵抗机制的病例中，可应用更复杂的空间方法（如mIF、DSP、IMC或空间转录组学），因其较高成本和技术复杂性限制常规使用。
8. Conclusions
预测黑色素瘤患者对ICI反应仍是一项重大临床挑战。过往研究表明，ICI疗效不仅取决于肿瘤内免疫细胞存在，还取决于其功能状态、空间组织以及与肿瘤细胞和基质的关系。因此，空间和高参数技术（常借助AI和机器学习算法）比经典单一生物标志物更好地反映TME的实际复杂性。同时，基于定量TIL评估和常规H&E玻片分析的更简单、易获取方法（常由AI方法支持）可显示显著预测价值，且成本较低、实施潜力较大。最具前景的方向似乎是开发整合常规组织病理学数字分析与更先进TME空间特征的模型。然而，方法的标准化、外部验证和精心设计的前瞻性研究仍是临床实施的先决条件。
