负载脑源性神经营养因子(BDNF)的透明质酸水凝胶促进Aβ诱导损伤的神经干细胞向神经元分化及在5×FAD小鼠中的神经发生作用

《Fibers》：BDNF-Hyaluronic Acid Hydrogel Promotes Neuronal Differentiation of Neural Stem Cells in Aβ-Induced Injury and 5×FAD Mice

　　

目的：阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)与成年海马神经发生(adult hippocampal neurogenesis, AHN)受损相关。本研究旨在建立Aβ1–42寡聚物损伤的体外神经干细胞(neural stem cells, NSCs)模型，并在体内采用5×FAD转基因AD小鼠模型，评估负载脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)的透明质酸(hyaluronic acid, HA)水凝胶(BDNF-HA gel)对AHN的治疗效应。方法：体外将BDNF-HA gel与Aβ1–42寡聚物损伤的NSC球共培养，评估NSC增殖、迁移及分化。体内将BDNF-HA gel侧脑室灌注至5×FAD小鼠。研究人员采用溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2'-deoxyuridine, BrdU)标记、免疫荧光、顺行跨突触病毒示踪及行为学测试，评估BDNF-HA gel对成年神经发生、新生神经元整合入记忆环路及认知功能的影响。结果：体外BDNF-HA gel减轻Aβ1–42诱导的NSC凋亡，恢复增殖与迁移，促进向成神经细胞、新生神经元及少突胶质细胞分化，并缓解线粒体去极化及线粒体质量丢失。体内尽管5×FAD小鼠Aβ斑块负荷未显著减少，BDNF-HA gel明显增强侧脑室下区(subventricular zone, SVZ)及齿状回颗粒下区(subgranular zone, SGZ)的NSC增殖与神经发生。行为学测试进一步显示物体识别、空间工作记忆及空间参考记忆显著改善。结论：BDNF-HA gel可有效拮抗Aβ寡聚物诱导的毒性微环境，促进NSC增殖、迁移及向神经元分化。在不改变Aβ负荷的情况下，其显著增强成年神经发生并挽救AD小鼠认知缺陷。

论文解读：BDNF-HA水凝胶促进Aβ损伤神经干细胞神经发生及改善5×FAD小鼠认知功能

研究背景与立项依据

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一种以记忆损害、细胞外β-淀粉样蛋白(amyloid-β, Aβ)斑块沉积及细胞内tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结为特征的进行性神经退行性疾病，最终导致海马区神经元严重损伤与丢失。目前靶向Aβ或tau病理的治疗策略未能在临床产生明确的认知获益。大量研究表明AD患者及动物模型中成年海马神经发生(adult hippocampal neurogenesis, AHN)——即位于齿状回(dentate gyrus, DG)颗粒下区(subgranular zone, SGZ)的神经干细胞(neural stem cells, NSCs)持续产生新神经元的过程——显著减退，且神经发生受损早于Aβ斑块沉积与认知缺陷，可能是AD进展的早期病理特征。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)是调节AHN的关键因子，通过高亲和力受体TrkB发挥作用，但外源性BDNF半衰期短、易降解且难以穿越血脑屏障。将BDNF包封于生物相容性好、具缓释特性的透明质酸(hyaluronic acid, HA)水凝胶中可克服上述局限。因此，研究人员开展本研究，探讨BDNF-HA gel在Aβ_1–42寡聚物损伤的体外NSC模型及5×FAD小鼠体内对神经发生的促进作用及认知改善效应。该研究成果发表于《Biomedicines》。

主要关键技术方法

研究人员分离新生Sprague-Dawley(SD)大鼠海马原代NSC球进行体外培养；制备可溶性Aβ_1–42寡聚物模拟AD毒性微环境；将重组BDNF混入HA溶液制备BDNF-HA gel缓释系统。体外实验设对照组、Aβ_1–42+HA gel组及Aβ_1–42+BDNF-HA gel组，进行分化培养并通过TUNEL检测凋亡，免疫荧光标记Nestin/Sox2(未分化NSC)、Ki67/BrdU(增殖)、DCX(成神经细胞)、βIII-Tubulin/Tuj1(新生神经元)、Olig2(少突胶质细胞)、GFAP(星形胶质细胞)，JC-1探针测线粒体膜电位(MMP)、Mito-Tracker Green测线粒体质量。体内实验选用5×FAD转基因小鼠(C57BL/6J背景)，经立体定位植入套管行侧脑室(intracerebroventricular, ICV)单次灌注BDNF-HA gel或PBS对照，野生型(wild type, WT)小鼠作正常对照；连续腹腔注射BrdU标记增殖细胞；取脑行冰冻切片免疫荧光检测SVZ及DG区Sox2⁺GFAP⁺BrdU⁺(活化NSC)、DCX⁺/PSA-NCAM⁺(成神经细胞)、NeuN⁺BrdU⁺(新生成熟神经元)、Parvalbumin(PV⁺, 小清蛋白阳性)GABA能中间神经元；向内嗅皮层(entorhinal cortex, EC)注射表达EGFP的1型单纯疱疹病毒(HSV-EGFP)行顺行跨突触示踪以验证新生神经元环路整合；采用新物体识别(new object recognition, NOR)、Y迷宫自发交替(Y-maze spontaneous alternation)及Barnes迷宫空间参考记忆测试评估认知功能；数据以均值±标准差表示，Shapiro–Wilk检验正态性，Student's t检验或单因素方差分析(one-way ANOVA)结合Tukey事后检验，p<0.05为差异显著。

研究结果

3.1. Cultured Neurospheres Express NSC Markers Nestin and Sox2

免疫荧光证实原代培养悬浮细胞球贴壁后共表达Nestin与Sox2，确认为NSC球。

3.2. BDNF-HA Gel Attenuates Aβ Oligomer-Induced Apoptosis in NSC Spheres

Aβ_1–42寡聚物处理使NSC球TUNEL⁺凋亡细胞比例显著升高(p<0.001)，BDNF-HA gel共处理显著降低凋亡率(p<0.01)，表明BDNF-HA gel拮抗Aβ诱导的NSC凋亡。

3.3. BDNF-HA Gel Promotes Proliferation in Aβ_1–42Oligomer-Impaired NSCs

Aβ_1–42显著降低Nestin⁺Ki67⁺、Sox2⁺Ki67⁺及Nestin⁺BrdU⁺、Sox2⁺BrdU⁺双阳性细胞数(p<0.01或p<0.001)；BDNF-HA gel使上述增殖NSC数量显著回升(p<0.05或p<0.01)，证明BDNF-HA gel恢复Aβ损伤的NSC增殖能力。

3.4. BDNF-HA Gel Promotes Migration in Aβ_1–42Oligomer-Impaired NSCs

Aβ_1–42抑制NSC球向外迁移的突起长度与数目(p<0.01或p<0.001)，BDNF-HA gel显著逆转此抑制(p<0.05)，部分恢复NSC迁移与突起生长。

3.5. BDNF-HA Gel Rescues Neuroblast Generation from Aβ_1–42-Impaired NSCs

分化第14天Aβ_1–42使DCX⁺Ki67⁺成神经细胞减少(p<0.01)，BDNF-HA gel使其显著增加(p<0.05)，表明BDNF-HA gel促进Aβ损伤下NSC向成神经细胞分化。

3.6. BDNF-HA Gel Preferentially Rescues Neuronal and Oligodendroglial Differentiation from Aβ_1–42-Impaired NSCs

分化第21天Aβ_1–42降低Tuj1⁺Ki67⁺新生神经元比例(p<0.01)，第28天减少Tuj1⁺神经元及Olig2⁺少突胶质细胞数(p<0.001)，GFAP⁺星形胶质细胞数无组间差异；BDNF-HA gel显著提升Tuj1⁺及Olig2⁺细胞数(p<0.05)，对GFAP⁺无影响，说明BDNF-HA gel优先促进神经元与少突胶质细胞谱系分化。

3.7. BDNF-HA Gel Mitigates Mitochondrial Dysfunction Under Aβ_1–42Oligomer Impairment

Aβ_1–42使JC-1红/绿荧光比值下降(线粒体去极化)及Mito-Tracker Green荧光强度降低(线粒体质量减少)(p<0.001)；BDNF-HA gel部分恢复JC-1比值与线粒体质量(p<0.05)，提示BDNF-HA gel通过维护线粒体功能支持神经发生。

3.8. Neurogenic Effects of BDNF-HA Gel Are Independent of Aβ Reduction

5×FAD小鼠海马DG区Aβ沉积随龄增加(2~5月龄)，3月龄始注BDNF-HA gel至5月龄不改变DG区Aβ斑块负荷，证实BDNF-HA gel的神经发生效应不依赖Aβ清除。

3.9. BDNF-HA Gel Promotes NSCs Proliferation in the SVZ of 5×FAD Mice

5×FAD+PBS组SVZ区Sox2⁺BrdU⁺及Sox2⁺Ki67⁺细胞较WT减少(p<0.001)；BDNF-HA gel处理后二者显著增多(p<0.05)，表明BDNF-HA gel在体内激活SVZ内源性NSC增殖。

3.10. BDNF-HA Gel Enhances Neurogenesis in the SVZ of 5×FAD Mice

连续7天BrdU标记显示5×FAD+PBS组SVZ区DCX⁺BrdU⁺及DCX⁺Ki67⁺成神经细胞减少(p<0.001)，BDNF-HA gel使其回升(p<0.05)，证明BDNF-HA gel增强SVZ神经发生。

3.11. BDNF-HA Gel Enhances Adult Hippocampal Neurogenesis in 5×FAD Mice

海马DG区5×FAD+PBS组Sox2⁺GFAP⁺BrdU⁺活化NSC及PSA-NCAM⁺BrdU⁺成神经细胞较WT减少(p<0.001)；BDNF-HA gel分别使二者增加至约2倍及显著回升(p<0.05)，证实BDNF-HA gel促进成年海马神经发生。

3.12. BDNF-HA Gel Increases Production and Migration of Newborn Neurons in the Hippocampus of 5×FAD Mice

BDNF-HA gel使DG区NeuN⁺BrdU⁺新生成熟神经元密度较PBS组升高(p<0.05)，并计算迁移指数(migration index = 迁移距离m/颗粒细胞层宽度w×100%)显示新生神经元向颗粒细胞层(granular cell layer, GCL)迁移增强(p<0.05)。同时BDNF-HA gel减轻5×FAD小鼠海马PV⁺GABA能中间神经元丢失(p<0.01)及树突长度缩短(p<0.05)，具广泛神经保护。

3.13. The Newborn Neurons Treated with BDNF-HA Gel Anatomically Integrated into the Entorhinal–Dentate Memory Circuit

EC注射HSV-EGFP跨突触标记DG颗粒细胞，发现BDNF-HA gel组部分NeuN⁺BrdU⁺新生神经元共标HSV-EGFP，证明治疗产生的新生神经元接受EC传入突触输入，解剖学整合入内嗅皮层-齿状回(EC-DG)记忆环路。

3.14. BDNF-HA Gel Ameliorates Cognitive Dysfunction in 5×FAD Mice

NOR测试BDNF-HA gel组识别指数高于PBS组(p<0.01)；Y迷宫自发交替率高于PBS组(p<0.05)；Barnes迷宫各组运动速度无差异前提下BDNF-HA gel组找到目标洞潜伏期短于PBS组(p<0.05)。综合表明BDNF-HA gel改善物体识别记忆、空间工作记忆及空间参考记忆缺陷。

讨论与结论总结

研究人员讨论指出，Aβ_1–42寡聚物体外模型可重现AD神经发生抑制表型，BDNF-HA gel通过缓释BDNF拮抗Aβ毒性、恢复线粒体功能并促进NSC增殖与神经元/少突胶质细胞分化。HA水凝胶克服游离BDNF不稳定及BBB穿透难题，在体侧脑室给药虽为实验性途径但证实概念可行。BDNF-TrkB轴及其下游信号激活是促神经发生的重要机制。研究局限性包括未系统解析TrkB下游信号通路、BDNF剂量未进一步优化、新生神经元功能电生理验证缺失及未检测突触结构功能。作者指出未来需探索更便利给药途径及突触层面机制。

结论翻译：综上所述，BDNF-HA gel在Aβ毒性条件下促进NSC增殖、迁移、神经元分化及维护线粒体功能。在5×FAD小鼠中，其在不减少Aβ负荷的情况下增强SVZ与DG区成年神经发生，促使新生神经元解剖学整合入EC-DG记忆环路，并改善认知缺陷。结果表明HA水凝胶缓释BDNF可有效恢复内源性神经发生潜能，为AD提供了一种有前景的淀粉样蛋白非依赖性再生治疗策略。