《Journal of Virology》：Pre-pandemic contraction, phase-specific rate variation, and site-specific antigenic adaptation shape influenza A(H3N2) evolutionary dynamics in Hubei, China
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摘要：甲型流感病毒A(H3N2)是季节性流感流行的重要病原，但其在大流行(COVID-19 pandemic)期间及之后的进化特征尚不完全清楚。研究人员分析了2017—2024年中国湖北省流感监测数据及血凝素(hemagglutinin, HA)与神经氨酸酶(
摘要：甲型流感病毒A(H3N2)是季节性流感流行的重要病原，但其在大流行(COVID-19 pandemic)期间及之后的进化特征尚不完全清楚。研究人员分析了2017—2024年中国湖北省流感监测数据及血凝素(hemagglutinin, HA)与神经氨酸酶(neuraminidase, NA)基因序列。结果显示，流行活动在2020年前呈规律季节性，2020—2022年近乎消失，2022年中后期重新抬头并出现强高峰。大流行前多个HA谱系共循环，观察到数例局部重配(reassortment)信号，但整体亚型内重配证据有限。复现后单一优势分支扩张、遗传多样性下降且分支更替(clade turnover)明显。贝叶斯溯祖(Bayesian coalescent)分析显示有效种群大小(effective population size, Neτ)在2019年末—即SARS-CoV-2广泛传播及非药物干预措施实施前—已开始下降。松弛分子钟(relaxed molecular clock)与选择压力分析揭示不同谱系间HA替代速率存在异质性，可能反映基础替代速率差异及传播瓶颈(transmission bottleneck)效应，而非可检测的选择强度改变。总体而言，HA和NA进化以纯化选择(purifying selection)为主，少数抗原区位点显示正选择(positive selection)迹象并与反复出现的氨基酸替换相吻合。大流行前群体收缩、阶段特异性速率变异及位点特异性抗原适应共同塑造了湖北省H3N2谱系更替与流行模式。监测种群变化、谱系特异性速率及关键抗原替换有助于指导疫苗更新并强化防控准备。
本研究围绕2017—2024年中国湖北省甲型流感病毒A(H3N2)的流行病学特征与分子进化动态展开。研究背景方面，季节性流感每年致全球约29万至65万死亡，其中A(H3N2)自1968年香港流感大流行以来持续流行且进化速率快于其他亚型，其HA球状头区易发生抗原漂移(antigenic drift)，加之分节段基因组可发生基因重配(reassortment)，是新疫苗株推荐的主要对象。已有研究表明H3N2在中国呈现冬春季流行高峰，且东亚、东南亚常为全球新变种的源头，但COVID-19大流行期间非药物干预(non-pharmaceutical interventions, NPIs)几乎中断其传播，B/Yamagata系甚至疑似消失，而H3N2复现后的进化动态——包括大流行本身及前期潜在因素对其长期进化的影响——尚缺乏区域尺度的整合分析，尤其缺少对有效种群大小变化时机、谱系特异性进化速率异质性及各阶段选择压力的联合评估。为此，研究人员整合湖北省流感监测阳性数据与HA、NA基因序列，旨在刻画大流行前、期间及后大流行三个阶段的流行活动变迁、遗传多样性波动、系统发生拓扑结构、种群动态、地理扩散、重配情况及选择模式，以明确H3N2在区域尺度上的进化驱动因素。研究得出结论：H3N2有效种群在2019年中后期即显著收缩（早于NPIs实施），复现后遗传多样性降低且单一优势分支主导，HA各谱系替代速率存在阶段性异质性与传播瓶颈相关而非选择压力改变，整体以纯化选择为主并仅在少数抗原位点检出正选择，连续基因组监测对预测后续流行至关重要。该论文发表于《Journal of Virology》。
主要关键技术方法：研究人员基于中国流感监测信息系统(China Influenza Surveillance Information System, CNISIS)获取2017年1月至2024年12月湖北省哨点医院呼吸道标本实时荧光定量PCR(Real-Time Quantitative PCR, RT-qPCR)检测结果，选取A(H3N2)核酸阳性毒株分离培养后提取病毒RNA，进行HA与NA全长基因扩增及Illumina MiSeq测序并组装保守序列；运用MAFFT比对序列、IQ-TREE构建最大似然(maximum-likelihood, ML)系统发生树并以Nextclade划分HA进化分支(clade)；采用MEGA计算HA和NA基因核苷酸与氨基酸配对距离评估遗传多样性及与WHO推荐疫苗株匹配度，借助多维标度(multidimensional scaling, MDS)展示遗传关系；通过TempEst检验时间信号(root-to-tip regression)，BEAST 2拟合不同核苷酸替代模型与松弛对数正态分子钟(uncorrelated lognormal relaxed clock, UCLN)进行贝叶斯系统发生推断及贝叶斯天际线图(Bayesian skyline plot, BSP)重建有效种群动态，结合离散系统地理模型(discrete phylogeography with continuous-time Markov chain, CTMC)推断省内地级市间扩散方向；使用CoalRE模块估算HA–NA重配率及绘制最大分支可信网络；应用HyPhy包中MEME、FEL、SLAC、FUBAR进行位点水平选择压力分析，aBSREL检验分支水平 episodic diversifying selection，RELAX比较预设高进化速率分支与参照分支的选择强度差异，并将BEAST所得分支特异性替代速率与CodeML推算的dS、dN及dN/dS进行Spearman相关分析；利用Nextclade比对A/Darwin/6/2021参考株识别HA氨基酸替换，PyMOL映射高频(≥70%)替换至HA三聚体结构(PDB: 9BDF)。
研究结果如下：
temporal dynamics of influenza A(H3N2) in Hubei, 2017–2024（湖北省2017—2024年A(H3N2)时间流行动态）：通过对435,556份呼吸道标本中24,616例H3N2阳性数据的月度阳性率分析，研究人员划分出三阶段——大流行前(2017—2020年1月)呈冬春峰偶伴夏季峰、大流行抑制期(2020年2月—2022年5月)阳性率极低近消失、后大流行复现阶段(2022年6月—2024年)2022年7月出现研究期内最高阳性率(45.4%)后恢复冬春峰并于2023年底达单月最高病例数，2024年活性再降；Kruskal–Wallis检验证实三阶段阳性率差异显著(P < 0.001)，表明H3N2活动存在时间异质性。
Phylogenetic and genetic features of H3N2 viruses in Hubei, 2017–2024（湖北省2017—2024年H3N2病毒系统发生与遗传学特征）：基于134株本地分离株联合参考与疫苗株构建HA与NA ML树，大流行前多分支(3C.3a1、3C.2a、3C.2a1等)共循环体现高遗传异质性；2022年后见3C.2a1b.2a.1a.1占优且部分序列一致，2023—2024年由高度均质单系群3C.2a1b.2a.2a.3a.1主导。NA树遗传距离较短且部分拓扑与HA不一致(如3C.2a2关联两不同NA谱系)，RDP4未检出节段内重组，提示HA–NA拓扑分歧可能源于其他进化过程(如重配)。
Genetic diversity and vaccine match of H3N2 viruses（H3N2病毒遗传多样性与疫苗匹配度）：HA与NA平均配对核苷酸距离大流行前较高(分别约0.013–0.015与0.011–0.012)，2022年骤降至约0.003与0.002，2023—2024年部分回升(约0.007与0.005)，bootstrap比较显示大流行前后差异具统计学意义。HA氨基酸与当季WHO疫苗株距离2019—2020年最大(MDS展示毒株聚类与时相疫苗株偏移)，提示某些季节疫苗株与循环株存在抗原错配。
Temporal signal and model adequacy（时间信号与模型适用性）：HA与NA root-to-tip回归R2分别达0.967与0.941，具充足时间信号可进行分子钟推断；贝叶斯模型平均优选TVM+Γ替代模型，宽松与严格时钟对数边际似然差小，但HA后验ucldStdev = 0.502(95% HPD 0.280–0.767)显示明显谱系间速率异质性，故两基因均采纳UCLN松弛时钟以保证一致性。
Time-scaled Bayesian phylogeny of H3N2 viruses（H3N2病毒时间标定贝叶斯系统发生树）：HA与NA基因平均替代速率分别为4.448×10?3subs/site/year(95% HPD 3.509–5.458×10?3)与3.409×10?3subs/site/year(95% HPD 2.667–4.101×10?3)，最近共同祖先(time to most recent common ancestor, tMRCA)均约2014年中后期。HA部分内部节点后裔分支具较高后验中位替代速率，对应节点时间(2016.52、2018.19、2020.04)与流感低活跃时段重合，其下分别对应3C.2a1/3C.2a1b.1、3C.2a1b.2及复现后两大优势亚支的扩张，提示流感低活动期某些谱系可能出现相对升高之替代速率。
Population dynamics and discrete phylogeographic patterns（种群动态与离散系统地理扩散模式）：BSP显示有效种群大小2017—初2019为高平台，2019年中后期明显下降并于2019年末达低值平台并延续至2024年——此收缩早于2020年1月NPIs实施。离散系统地理推断根状态后验概率最高为咸宁(0.31)，推断扩散路径由咸宁→荆门→宜昌及黄冈，武汉与荆门为继发扩散枢纽，但该结果不确定性偏高需谨慎解读。
Reassortment dynamics revealed by coalescent analysis（基于溯祖分析揭示的重配动态）：CoalRE估算平均重配率为0.166 events/lineage/year(95% HPD 0.027–0.335)，MCC网络呈树状结构伴局部重配信号；大流行前见数例较高后验支持(>0.85)假定重配事件，2022年后仅见单低支持事件，表明重配模式存在阶段异质性。
Selective pressure patterns in HA and NA genes（HA与NA基因选择压力模式）：整体dN/dS(ω)约0.26–0.29，受强烈纯化选择约束；HA少数位点(如密码子160与193，H3编号排除信号肽)经多方法(MEME/FEL/SLAC/FUBAR)一致支持为正选择，NA几无正选择信号。aBSREL未见分支水平episodic diversifying selection；RELAX检验高速率分支未显示选择强度放松或增强(K = 0.82, P = 0.364)；BEAST分支速率与CodeML推导之同义(dS)、非同义(dN)及ω均显著正相关(ρ分别为0.509、0.396、0.328, 均P < 0.001)，但相关系数两两比较无统计差异，说明速率变异更多与基础替代速率及种群过程(如瓶颈致遗传漂变影响突变固定)有关，未检测到选择强度整体偏移。
Temporal dynamics of high-frequency HA substitutions（HA高频氨基酸替换的时间动态）：相对于A/Darwin/6/2021，HA1高频(≥70%)替换集中于抗原位点B区，部分(S156H/N159Y/Q164L/N190D)大流行前已存在并跨波次保留；特定位点随时间更替(D186G→D186S, G53D→G53N)；后大流行新阶段出现I48T/E50K/N96S/I140K/I192F/S198P/I223V等新高频替换，HA2仅少量高频替换，符合HA1主导抗原进化之认知。
讨论部分总结(含原文结论要点翻译)：研究人员指出，湖北省H3N2在大流行前呈典型华中冬春峰且多分支共存，HA–NA拓扑不一致及溯祖重配推断支持亚型内基因重配；复现后遗传多样性降低、单一优势分支相继更替且2022年后重配证据减少，2022年夏季异常高峰或与"免疫负债(immunity debt)"相关——即长期低流通致易感人群积累。系统地理提示咸宁可能为早期引入源并沿荆门、武汉向周边扩散，与我国南方至北方传播动态大致相符但需谨慎对待。关键发现其一，有效种群大小缩减始于2019年中后期、早于SARS-CoV-2广泛传播及NPIs，或可归因于疫苗接种改变群体免疫水平及区域/国际传播链变动等多因素。其二，松弛分子钟下HA各谱系替代速率存在异质性，高速率分支多对应低流行时段且其下特定分支后续扩张/占优，鉴于未检测到选择强度变化，更符合传播瓶颈与谱系更替等种群过程引致之遗传漂变作用，而非适应性进化加速。其三，H3N2 HA以纯化选择为主，仅在少数功能热点(如抗原位点160关联158–160糖基化、193位于受体结合区、131–135/144涉及糖基化调变抗原性、198参与受体结合与宿主适应)检出正选择，这些位点与数据中高频替换重叠但不全成优势突变，受适合度或上位效应(epistatic interactions)约束。综上，大流行前群体收缩、反映种群与流行病学过程的阶段特异性速率变异及局限于少数位点的抗原适应性共同主导区域H3N2进化轨迹；研究局限包括区域采样与年度病例波动可能影响罕见谱系检出，未来需结合功能验证与全球数据整合以服务公共卫生干预。
