《Journal of Virology》：Scanning the horizon: deep mutational scanning approaches in virology
编辑推荐：
研究突变效应是病毒学的核心。深度突变扫描（deep mutational scanning, DMS）是一种将高通量诱变（high-throughput mutagenesis）与深度测序（deep sequencing）相结合，在混合检测中测量突变效应的技术
研究突变效应是病毒学的核心。深度突变扫描（deep mutational scanning, DMS）是一种将高通量诱变（high-throughput mutagenesis）与深度测序（deep sequencing）相结合，在混合检测中测量突变效应的技术。当应用于病毒时，DMS加速了对病毒基因组中突变效应的全面测量，描绘了病毒蛋白上的进化约束。最近，DMS已被应用于病毒学和病毒进化中更广泛的问题，量化了突变跨宿主物种、组织环境和免疫压力的效应。自DMS首次应用于病毒学以来，合成生物学（synthetic biology）改变了突变文库的工程化，开启了新的探索问题。随着技术现在成熟，DMS有望以新的、令人兴奋的方式改变研究人员对病毒进化的理解。本综述将综合DMS方法在病毒学应用中的最新技术和概念进展、其所产生的见解以及未来研究的机会。
**INTRODUCTION**
深度突变扫描（deep mutational scanning, DMS）方法的发展从根本上改变了研究人员将病毒基因型与表型关联的能力，加速了对病毒进化和蛋白质功能的理解。本综述将DMS定义为一套利用合成生物学在目标蛋白质中工程化多样性，随后通过测序（在连续传代后或选择前后）评估每个突变表型效应的方法。生成变异文库的方法、可探索的突变类型以及DMS所应用系统和生物学问题正在不断扩展，研究人员希望提供当前领域进展和机遇的广泛概述，以及设计此类研究时需考虑的实验和分析因素。DMS方法特别适合病毒学问题：一方面，病毒是相对简单的遗传系统，通常可由单个或多个质粒产生完全具有感染性的已知基因型病毒；另一方面，病毒蛋白质组复杂，蛋白质常具有多功能性，形成复合物并响应环境信号。DMS是对实验进化的一种补充，与传统“传代后测序”方法相比，它能以高通量方式同时评估所有可能单突变的适应度效应，揭示了极其高分辨率的局部“序列空间”图像。
**DEEP MUTATIONAL SCANNING APPROACHES**
**Technological development**
DMS领域自21世纪初高通量测序技术出现以来快速发展。2011年发展出目前常见的DMS方法，但此前已有利用转座子诱变、化学诱变或易错PCR等早期技术。首种常用方法使用编码简并密码子的引物池对目标区域进行PCR扩增，引入密码子替换（图1a）。近期，基于合成寡核苷酸池（oligopools）的文库设计已成为主要方法，其得益于Twist Bioscience或GenScript等公司的高通量寡聚物合成技术，使研究人员能直接合成带有设计突变序列并克隆至目标质粒（图1b）。计算工具如饱和可编程插入工程（Saturated Programmable INsertion Engineering, SPINE）和深度插入缺失可编程文库工程（Deep Indel Missense Programmable Library Engineering, DIMPLE）进一步自动化了设计流程。两种主要方法各有优缺点：简并引物法成本效益高且设计灵活，但无法高效生成插入缺失，且大规模扫描时繁琐；寡聚物池法设计稳健，提供精确的密码子使用控制、更完整的突变文库和实验灵活性，但成本较高且存在合成错误。
**Biosafety and non-infectious systems**
对于高致病性病毒或具有大流行潜力的病毒，生物安全和潜在的增益功能实验是重要考虑因素。这推动了非感染性系统的开发，包括使用假型病毒颗粒（如水疱性口炎病毒VSV、慢病毒）、噬菌体或酵母展示方法，从而在较低生物安全水平下筛选高后果病毒的单个蛋白。这些非感染性和假型模型在研究包膜病毒的结构蛋白方面特别有效，但非包膜病毒（如小核糖核酸病毒）不适用此类策略，需在感染性病毒背景下进行研究。先前的DMS工作表明，绝大多数突变不会增强病毒适应度，但严格的生物安全考虑仍然必不可少。
**Analysis of variant effects for DMS experiments**
DMS实验中变异效应（适应度效应）的基本估计是选择后突变的富集倍数或通过回归分析估计频率变化率。文库复杂性、实验设计和噪声来源要求更复杂的统计模型。已有多种计算工具用于变异计数和效应估计（表1），其统计方法（如频率学派与贝叶斯学派）和可处理的实验设计类型（时间序列与双样本）各不相同。常用可视化方法包括散点图、热图、序列标识图（sequence logo plots）、每位置效应线图、分数分布直方图以及将分数映射至三维蛋白质结构。
**Expanding the mutational repertoire of DMS**
传统DMS聚焦于氨基酸替换，现已扩展到检查插入和缺失以及非编码区突变的适应度效应，这得益于寡核苷酸文库合成和设计进展。一项显著创新是在目标蛋白特定位点工程化“插入把手”（insertional handle），其编码向外指向的II型限制性酶切位点，允许将任意目标序列插入每个工程化位点（图1c），从而实现成本高效的筛选，例如近期用于鉴定病毒蛋白质组中可耐受亲和标签或小报告基因插入的位点。
**INSIGHTS ACROSS BIOLOGICAL SCALES**
**Dissecting intrinsic molecular constraints**
DMS从根本上探究病毒蛋白质对突变的耐受性，这种耐受性由蛋白质折叠、稳定性、与病毒或宿主蛋白结合能力以及酶功能等物理和生物学约束共同决定。以小核糖核酸病毒为例，近期多项DMS筛选（如肠道病毒D68、柯萨奇病毒B3、肠道病毒A71和脊髓灰质炎病毒）已实现对整个病毒编码区的突变效应评估，量化结构蛋白和非结构蛋白上的进化约束。对于乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）这类具有重叠编码区的基因组，DMS通过分离不同开放阅读框的适应度，揭示了新的调控元件和蛋白质基序。
**Mapping escape from immune pressures**
病毒蛋白固有的形式和功能约束与免疫压力等外在选择压力相平衡。DMS的系统性特点使其能解析这些对立压力，尤其是在COVID-19大流行期间，DMS研究聚焦于SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合域和融合肽，以理解并预测逃逸抗体免疫的突变。在HIV包膜糖蛋白上的DMS表明，许多逃逸突变位于与抗体接触的位点，但也有一些远离已知表位，且与临床感染中观察到的逃逸突变高度一致。
**Overcoming extrinsic pressure from small molecule inhibitors**
病毒在面对小分子抑制剂和治疗性抗体时经常迅速进化出耐药性。DMS可表征耐药逃逸途径，识别能降低耐药可能性的有效组合。单突变赋予的耐药性常伴随功能权衡，如在丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV）聚合酶DMS中，某些在无抑制剂时高度有害的替换随药物剂量升高而变得有利。耐药突变的适应度缺陷常由次要突变补偿，例如艾滋病病毒（HIV）蛋白酶的组合DMS揭示了突变间的上位效应（epistasis），塑造了复杂的逃逸景观。近期研究通过将DMS与Zika病毒NS2B-NS3基因的晶体学片段筛选相结合，优先选择与高度保守残基相互作用的小分子，从而设计出不易产生耐药性的候选抗病毒药物。
**Identifying molecular determinants of host tropism**
病毒常表现出广泛的宿主范围或组织嗜性，DMS可帮助分析该特征。例如，在西尼罗病毒包膜蛋白上的DMS比较了人类、蚊子和鸟类来源细胞系中的适应度变化，揭示了不同环境中约束的差异。在基因治疗中，腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）的DMS筛选聚焦于衣壳蛋白，产生了多种具有改变组织嗜性、生产效率或稳定性的变异衣壳，并为机器学习提供了训练数据。
**Leveraging DMS for outbreak response**
在COVID-19大流行期间，DMS成为关键工具：在首条SARS-CoV-2序列公布6个月内生成了DMS数据集，为适应人类ACE2受体的途径提供了早期指标。结合基因组监测，DMS有效预测了变异株的出现，甚至能捕捉刺突蛋白突变间的复杂上位效应。针对有暴发潜力的新发或再发人畜共患病毒（如尼帕病毒、拉沙病毒、狂犬病毒），已开展DMS工作以阐明驱动跨种传播的因素并改进对策，未来跨病毒属的DMS数据集将定义遗传保守区域，用于设计泛属抗病毒药物和疫苗抗原。
**CONCEPTUAL CHALLENGES**
**Extrapolation of experimental constraint**
将DMS数据外推至病毒自然进化是其应用关键，但也存在挑战。例如，马亚罗病毒包膜蛋白的DMS在细胞培养中鉴定了宿主偏好性替换，但在全蚊子和小鼠中的筛选未产生清晰的选择信号，表明体内瓶颈和多样化选择压力会掩盖突变效应。流感病毒DMS数据已被用于指导系统发育分析中的位点特异性密码子替换模型（如phydms工具），识别自然进化偏离实验预期的位点。比较芜菁黄花叶病毒（West Nile virus）的DMS数据和相关黄病毒序列多样性，显示DMS数据能高度预测循环株的序列多样性，且与蜱传黄病毒的分歧更大。在亲缘关系较远的流感HA蛋白中，暴露表面的氨基酸偏好更相似，而核心残基受更多约束。两篇关于小核糖核酸病毒的基因组范围DMS比较显示，尽管序列一致性约50%，约束模式高度相似，差异反映出结构功能分歧和潜在药物靶点。
**DMS across selective landscapes**
进化景观是动态变化的，DMS跨选择梯度应用可剖析这些变化。在肠道病毒A71非结构蛋白上的DMS，在不同抑制剂浓度下进行，不仅证实了病毒靶向抑制剂富集其靶蛋白变异，还发现了新颖结果，如抑制3C蛋白酶导致另一种病毒蛋白酶2A出现突变，并且揭示了宿主因子招募的冗余机制。理解突变的多样性效应（pleiotropy）是关键，即一个突变在不同条件下可能影响多种功能，DMS已初步展示了这种框架的可行性。
**Higher-order mutational scanning**
DMS的主要优势在于大规模评估突变效应，但通常限于单个或两个氨基酸替换，而自然进化常通过突变组合实现。突变在不同遗传背景下的不同表型被称为上位效应（epistasis）。在SARS-CoV-2刺突蛋白中，N501Y替换引起与ACE2结合等性状的上位偏移，扩大了抗体逃逸突变库。直接测量高阶上位的主要挑战是组合爆炸，但研究人员已探索利用统计耦合分析、基于观测突变设计筛选以及新寡聚物池工程（如Twist Bioscience的Spread-Out Low Diversity, SOLD文库）等方法，使文库规模可控。
**Emerging computational tools that complement DMS**
为应对上位性和数据库偏差，蛋白质语言模型（protein language models, PLMs）正成为解读病毒蛋白质进化约束的关键工具。这些模型可利用广泛的训练数据预测突变对耐受性的影响，并在SARS-CoV-2中用于识别潜在关切变异。AlphaFold及相关深度学习结构预测工具通过将突变效应与结构关联，辅助解释在特定抑制剂条件下筛选得到的突变，并验证与DMS数据一致的结构预测。正式整合蛋白质语言模型和深度学习结构预测模型，是稳健预测突变结构和功能后果的下一步。
**CONCLUSION AND FUTURE DIRECTIONS**
在合成生物学和计算方法的快速进步下，DMS已转变病毒进化领域，使病毒学家能够在蛋白质组规模上将基因型与表型关联。未来工作将聚焦于扩展筛选以包括更广泛的环境条件，改进体外DMS数据向体内环境的外推；通过跨病毒家族的比较研究，深入探索进化过去，并通过系统性探索高阶遗传相互作用（上位效应）展望未来。DMS与蛋白质语言模型和先进结构预测等计算工具的协同，将增强对突变表型机制的理解。这些进展将进一步通过合作研究社区（如Atlas of Variant Effects, AVE中的病毒学兴趣小组）加速发展。
