基于多组学整合揭示活动性泛发性白癜风中涉及IL-8和TNF-α的ceRNA网络

《ImmunoTargets and Therapy》：Unveiling a ceRNA Network Involving IL-8 and TNF-α in Active Generalized Vitiligo by Multi-Omics Integration

　　

活动性泛发性白癜风（AGV）是一种以黑色素细胞进行性丢失为特征的自身免疫性疾病。然而，AGV的分子机制，特别是非编码RNA（ncRNA）及其与蛋白质组学变化的相互作用，尚不清楚。本研究旨在通过整合蛋白质组学和全转录组数据，系统识别AGV中的关键调控网络和分子变化。研究人员对3例AGV患者和3例健康个体（HIs）的全血样本进行了数据非依赖采集质谱（DIA-MS）和全转录组测序（WTS）。通过生物信息学分析鉴定差异表达蛋白（DEPs）、信使RNA（mRNA）、长链非编码RNA（lncRNA）、环状RNA（circRNA）和微小RNA（miRNA）。利用Cytoscape构建并可视化了共表达网络与竞争性内源RNA（ceRNA）网络。随后，通过定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）和免疫检测在独立队列中验证关键枢纽基因和细胞因子水平。研究共鉴定出15个DEPs和669个差异表达mRNAs（DEmRNAs），以及AGV中258个lncRNAs、29个miRNAs和44个circRNAs的显著改变。功能富集分析显示其参与趋化因子信号通路和溶酶体通路。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析揭示十个枢纽基因，包括CXCL8、CXCR1、CXCR2和IL1R2。研究人员建立了核心ceRNA调控网络，涉及lncRNAs（如NUTM2B-AS1、LINC00894）、circRNAs（如ASAP1、CDR2）和miRNAs（如hsa-mir-3613-3p、hsa-mir-511-5p），这些分子可能调控炎症反应。实验验证证实AGV患者促炎细胞因子IL-8和TNF-α水平显著升高，且十一个枢纽基因中九个的qRT-PCR结果与测序数据一致。该研究通过多组学整合分析揭示了新型ceRNA网络，并强调了IL-8和TNF-α在AGV中的显著上调，为理解AGV的转录后调控机制和炎症通路提供了新见解，并提供了潜在治疗靶点。

白癜风是一种以功能性黑色素细胞进行性丢失为特征的自身免疫性皮肤疾病，导致皮肤和黏膜的慢性色素脱失，全球患病率约为0.5%–2%。尽管该病不危及生命或导致躯体残疾，但患者常承受显著的心理社会负担，包括情绪困扰、社会污名、低自尊及生活质量下降，其严重程度可与银屑病或特应性皮炎相媲美。鉴于该疾病进程不可预测，深入研究以识别新型分子标志物并开发更有效的治疗靶点具有迫切必要性。

近年研究日益重视细胞因子在白癜风诊断中的作用，不同疾病阶段的蛋白水平变化有助于诊断及疗效评估。同时，竞争性内源RNA（ceRNA）作为一类通过充当天然miRNA海绵来调控基因表达的非编码RNA，其调控机制已在多种自身免疫和炎症疾病中得到证实，但在活动性泛发性白癜风（AGV）中的作用尚不明确。尽管已有研究通过转录组分析鉴定了白癜风皮损中差异表达的lncRNA和ceRNA网络，或通过蛋白质组学方法揭示了活动性白癜风患者血清中氧化应激相关蛋白的改变，但大多数研究聚焦于局限性或稳定期白癜风，AGV的整合蛋白质组学与转录组学图谱仍有待探索。因此，研究人员采用DIA-MS和全转录组测序对AGV进行了全面的多组学分析。

该研究中，研究人员采集了3例AGV患者和3例健康个体的全血样本，经伦理委员会批准并获取知情同意。血清用于4D标记定量蛋白质组学检测，外周血单个核细胞（PBMCs）用于转录组学分析。蛋白质组学分析采用Spectronaut Pulsar进行DIA数据处理，并用MaxQuant进行DDA数据鉴定；转录组学分析采用Illumina Truseq^TM RNA Sample Preparation Kit进行各类RNA测序，使用edgeR程序进行差异表达基因分析，并进行GO功能和KEGG通路评估。通过计算Pearson相关系数和p值构建lncRNA与mRNA的共表达网络，进而整合lncRNA-mRNA和circRNA-mRNA的共表达关系、miRNA-mRNA及miRNA-lncRNA的调控关系构建ceRNA网络，均采用Cytoscape软件进行可视化。在额外选取的10对AGV患者和健康个体中，通过qRT-PCR验证10个枢纽基因的表达，并以GAPDH为参照基因；采用ELISA检测血清细胞因子和自身抗体水平，通过流式细胞术测定淋巴细胞亚群。

研究结果显示，蛋白质组学分析共鉴定602个蛋白，其中15个DEPs（8个下调、7个上调）具有统计学意义。亚细胞定位分析显示DEPs主要位于细胞外、细胞核和细胞质；结构域预测提示GAF结构域、3',5'-环核苷酸磷酸二酯酶、胰腺核糖核酸酶和转化生长因子β样结构域可能在关键功能区域发挥重要作用。GO富集分析显示DEPs富集于胶原蛋白三聚体、RNA磷酸二酯键水解和核糖核酸酶A活性；KEGG通路分析则提示趋化因子信号通路和溶酶体通路最为显著。转录组学分析共鉴定669个DEmRNAs（245个上调、424个下调）、258个差异表达lncRNAs（93个上调、165个下调）、29个差异表达miRNAs（20个上调、9个下调）和44个差异表达circRNAs（23个上调、21个下调）。对非编码RNA靶基因或亲本基因的功能富集分析显示，其生物学过程主要涉及细胞器组织调控、细胞大分子代谢等；NF-κB信号通路、癌症和内吞作用为主要富集通路。

蛋白质组学与转录组学的相关性分析显示，362个DEPs与669个DEGs之间未检测到显著共表达，整体相关系数为?0.0199，这可能归因于样本量有限、组织特异性、转录后调控及蛋白质与mRNA半衰期差异等因素。基于PPI网络分析从top 60差异表达mRNA中鉴定出10个枢纽基因：CXCR1、CXCR2、CXCL1、CXCL8、IL1R2、KITLG、FCGR3B、XCR1、HBB和MME。ceRNA网络构建包括lncRNA-miRNA-mRNA网络（含8个lncRNAs、25个miRNAs和32个mRNAs）和circRNA-miRNA-mRNA网络（含17个circRNAs、22个miRNAs和32个mRNAs），关键调控因子包括lncRNAs NUTM2B-AS1、LINC00894、HELLPAR、AL590787.1，miRNAs hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-511-5p、hsa-miR-6818-3p，以及circRNAs ASAP1、CDR2、C18orf25。

实验验证方面，10对额外样本的ELISA检测显示AGV患者促炎细胞因子IL-8和TNF-α水平显著升高，但CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD19⁺、IL-10、IL-12p70、A-TG和A-TPO水平无显著变化。qRT-PCR验证显示除FCGR3B外，其余9个枢纽基因表达与测序数据一致：CXCL8、CXCR2、IL1R2、MME、CXCR1和CXCL1表达显著升高，而KITLG、HBB和XCR1表达显著降低。

在讨论部分，研究人员首先阐述了IL-8在白癜风进展中的核心作用。IL-8作为多功能细胞因子，在急性炎症反应中发挥关键作用，可抑制黑色素细胞增殖并诱导其凋亡，同时诱导中性粒细胞趋化。AGV患者IL-8表达显著高于健康个体，表明其在白癜风进展中的关键作用。IL-1R2作为IL-1的诱饵受体，是免疫应答的关键调节因子；KITLG（干细胞因子）膜结合形式在白癜风皮损中过表达，提示其可能在损伤后刺激黑素生成以作代偿。TNF-α对黑色素形成具有双向效应：既可诱导黑色素细胞损伤、抑制黑色素产生，也可改善黑色素细胞功能并维持其存活。

关于多组学数据的整合，研究人员指出蛋白质组与转录组之间缺乏显著共表达可能源于多种因素：有限的样本量降低了统计效能；组织特异性导致不同组织间基因表达变异显著；转录后调控（如mRNA稳定性、可变剪接和miRNA介导的调控）可独立于转录本丰度影响蛋白质合成；蛋白质的翻译后修饰亦可调节其功能与稳定性；此外，蛋白质与其对应mRNA的半衰期差异也导致了两者水平的时间差异。

在非编码RNA的ceRNA调控机制方面，hsa-miR-511-5p被阐明为免疫稳态的主调控因子，通过抑制STAT3/SOCS3促进M1型巨噬细胞极化，通过抑制BYSL增强树突状细胞功能以促进CD8⁺ T细胞活性，并通过靶向TRAF6/NF-κB减少IL-6/TNF-α产生以发挥抗炎效应。在白癜风中，hsa-miR-511-5p的缺失会破坏树突状细胞-T细胞通讯、损害抗氧化防御（KEAP1/Nrf2/HO-1）并破坏Th17/Treg平衡，从而增加促氧化自身免疫微环境以靶向黑色素细胞。hsa-miR-3613-3p则调控细胞周期（BIRC5/CDK1/NUF2）和氧化应激反应，其下调可能损害Nrf2介导的抗氧化防御，而BIRC5过表达促进自身抗原暴露和CD8⁺ T细胞活化；CDK1失调可破坏T细胞周期，加剧Th17/Treg失衡和自身免疫性黑色素细胞破坏。HELLPAR通过海绵吸附hsa-let-7i-5p促进RRM2表达，从而加剧氧化应激和抗氧化反应受损，并通过STAT3激活和自身抗原呈递受损驱动Th17极化同时抑制Treg，促进黑色素细胞攻击的炎症环境。C18ORF25通过维持钙稳态调节黑色素细胞功能，其缺乏导致细胞内钙平衡破坏、氧化应激和凋亡；作为AMPK底物，其通过AMPK/mTOR自噬通路调节细胞存活，并影响GTPase活性促进Th17反应和细胞毒性T细胞浸润，而PKA/cAMP信号受损增强促炎细胞因子（IFN-γ/IL-17）产生。ASAP1则调节免疫细胞迁移并抑制NF-κB介导的炎症反应以维持免疫稳态，其缺失可能激活AKT信号导致黑色素细胞氧化应激和自噬功能障碍，促进自身抗原暴露和Th17分化，触发针对黑色素细胞的自身免疫攻击。

研究结论部分明确指出：该整合多组学分析揭示了AGV中新型ceRNA网络，并强调了IL-8和TNF-α的显著上调。这些发现为理解驱动AGV的转录后调控机制和炎症通路提供了新见解，并提供了潜在治疗靶点。研究人员同时指出，尽管该研究使用同一样本队列以探索精准医学治疗靶点并避免样本间异质性的潜在影响，但样本量较小（仅3对AGV患者和健康对照）限制了统计效能和结果的普适性，增加了Ⅱ类错误风险，可能导致结果在更大队列中重现性降低。尽管多组学发现为AGV中IL-8/TNF-α轴和ceRNA网络提供了新见解，但其临床转化仍需进一步验证。目前DIA-MS和全转录组测序的高成本和复杂性限制了其常规诊断应用，然而鉴定出的生物标志物如IL-8、TNF-α、CXCR1和CXCR2未来有望通过ELISA、qRT-PCR或流式细胞术进行检测，该研究为开发简化的、具有成本效益的检测方法以指导治疗决策和疾病活动监测奠定了分子基础。