《Genes》：Biallelic ATG9B Variants Define a Novel Autophagy-Related Neurodevelopmental Disorder with Cerebellar Ataxia
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背景/目的：自噬（Autophagy）是高度保守的真核生物细胞过程，其功能异常可导致癌症及神经退行性疾病等人类疾病。自芽殖酵母中发现的自噬相关（Autophagy-related, ATG）基因为自噬的核心组分，核心自噬基因 ATG5 和 ATG7 的突变曾被
背景/目的：自噬（Autophagy）是高度保守的真核生物细胞过程，其功能异常可导致癌症及神经退行性疾病等人类疾病。自芽殖酵母中发现的自噬相关（Autophagy-related, ATG）基因为自噬的核心组分，核心自噬基因 ATG5 和 ATG7 的突变曾被报道可引起常染色体隐性遗传的罕见遗传病。方法：本研究首次报道人类 ATG9B 基因变异作为常染色体隐性遗传罕见神经发育疾病的致病因素。在三个有血缘关系的独立家系中检测到三种不同突变，共累及五名患者。结果：第一种变异为 11 核苷酸缺失导致移码，引入提前终止密码子并使 ATG9B 蛋白 C 端胞质域被截短；第二种为跨膜区关键氨基酸改变的点突变；第三种为 2 核苷酸缺失导致另一种截短产物。患者表现为智力障碍、行为异常、先天性小脑性共济失调、轻度小脑萎缩及小头畸形等多种神经发育异常。由于人 ATG9B 特异性表达于胎盘，研究人员假设疾病起源于胎盘发育阶段。为表征首个移码突变的影响并探究 ATG9B 生理功能，研究人员使用哺乳动物细胞及基因敲入（Knock-in, KI）小鼠模型进行实验。截短 ATG9B 在细胞中不稳定，可与野生型（Wild Type, WT）蛋白共定位于核周囊泡但不分布于外周囊泡。纯合 KI 小鼠存活、可育且无明显表型异常，胎盘各层组织形态计量学分析与对照组无显著差异，神经行为测试亦相似，但 KI 小鼠恐惧记忆呈减弱趋势（涉及杏仁核）。结论：本研究描述了一种新型 ATG9 相关罕见病，包括小脑性共济失调及萎缩，与 ATG5 和 ATG7 相关疾病表型相似。
论文解读：《Biallelic ATG9B Variants Define a Novel Autophagy-Related Neurodevelopmental Disorder with Cerebellar Ataxia》发表于 Genes
一、研究背景与立项依据
自噬（Autophagy，特指巨自噬 Macroautophagy）是维持细胞内稳态的关键分解代谢过程，其核心机制涉及约20种 ATG 蛋白。其中 ATG9A 与 ATG9B 是唯一的跨膜蛋白，负责介导膜脂双向转运以启动吞噬泡（Phagophore）形成。ATG9B 是脊椎动物特异性旁系同源物，在人胎盘合体滋养层中高表达，可在一定程度上补偿 ATG9A 功能。既往仅有 ATG5 和 ATG7 的突变被证实引起常染色体隐性遗传性神经发育障碍伴脊髓小脑性共济失调，其他核心自噬基因与人类孟德尔遗传神经发育病的联系尚未见报道。鉴于 ATG9B 在胎盘发育及潜在神经发育中的作用不明，且近亲婚配家系中原因不明的神经发育迟缓伴小脑性共济失调患者缺乏分子诊断，研究人员开展本研究以鉴定 ATG9B 双等位基因（Biallelic）致病变异并阐明其病理关联。
二、主要关键技术方法概述
研究人员通过三家独立临床队列——土耳其近亲家系（Family 1，全外显子测序 Whole-Exome Sequencing, WES）、阿尔及利亚近亲家系（Family 2，WES）及巴基斯坦近亲家系（Family 3，WES）——进行候选致病变异筛选与 Sanger 验证，遵循常染色体隐性遗传及次要等位基因频率过滤策略。体外构建野生型（WT）及截短型（TR）ATG9B-FLAG/myc 真核表达载体，转染 HEK293T 和 HeLa 细胞，通过 Western Blot、RT-PCR 及免疫荧光显微术分析蛋白稳定性与亚细胞定位。利用 BeWo 和 JAR 绒毛膜癌细胞系经 Forskolin 诱导合体化（Syncytialization），检测 ATG9B 转录水平变化。应用 CRISPR/Cas9 介导同源定向修复（HDR）构建小鼠 Atg9b 基因敲入（KI，C 端截短）模型，进行胚胎胎盘组织形态计量学分析及胎盘发育相关基因（Gcm1、SynA、SynB、Cebpa）RT-PCR。对成年纯合 KI 与 WT 小鼠实施旷场测试（Open Field Test, OFT）、新物体识别（Novel Object Recognition, NOR）、新位置识别（Novel Location Recognition, NLR）、社会偏好/新颖性测试、埋珠实验及被动回避测试（Passive Avoidance Test）等行为学评估。
三、研究结果
3.1. Case Reports
通过对三家家系先证者及受累成员的临床表现汇总：Family 1（土耳其）两名同胞表现为智力障碍、注意力缺陷、肥胖及面部畸形，头颅 MRI 正常；Family 2（阿尔及利亚）两名同胞表现为轻中度智力障碍、肌阵挛震颤、小脑性共济失调（SARA 评分 12/40）、构音障碍及小脑萎缩；Family 3（巴基斯坦）先证者为全面发育迟缓、攻击性行为及小头畸形（?1.89 SD），MRI 正常。结论：ATG9B 双等位基因变异患者具异质性神经发育表型，小脑性共济失调与小脑萎缩为部分家系特征。
3.2. Identification of the ATG9B Variants
WES 与 Sanger 测序鉴定出三种致病变异：Family 1 为 NM_001317056.2:c.2083_2093del（p.Leu695fs），致 C 端胞质域丢失；Family 2 为 c.1696G>A（p.Gly566Arg），位于跨膜螺旋 4 且高度保守；Family 3 为 c.2361_2362del（p.Cys788SerfsTer65），致 C 端截短。所有受累者为纯合子，父母为杂合子，符合常染色体隐性遗传。结论：三种 ATG9B 变异为该神经发育障碍的潜在致病突变。
3.3. ATG9B Expression Increases upon Syncytialization
以 Forskolin 处理 BeWo（可融合）和 JAR（不融合）细胞，BeWo 出现细胞融合且合体滋养层标记 hCGβ 升高，同时 ATG9B mRNA 显著上调；JAR 中 hCGβ 升但 ATG9B 无变化。结论：人 ATG9B 转录受滋养层合体化调控，在合体滋养层中特异性高表达。
3.4. Localization of WT and Truncated ATG9B in Cells
转染 HeLa 细胞显示 WT 与截短 ATG9B 均定位于高尔基体反面网络（Trans-Golgi Network, TGN）囊泡（共定位 Golgin-97），但截短蛋白形成异常大囊泡聚集体并引起高尔基体形态异常。结论：截短 ATG9B 保留部分 TGN 定位能力但引发囊泡形态学改变。
3.5. Truncated ATG9B Is Not Stable
等量转染 WT 与 TR 质粒后，Western Blot 及免疫荧光显示截短 ATG9B 蛋白水平显著低于 WT，而二者细胞内 mRNA 水平相当。结论：截短 ATG9B 蛋白翻译后不稳定，发生降解而非转录水平下调。
3.6. Development of a Knock-In Mouse Model Expressing Truncated ATG9B
利用 CRISPR/Cas9 在小鼠 Atg9b 外显子 9 引入提前终止密码子模拟人 p.Leu695fs 截短。纯合 KI 小鼠出生比例符合孟德尔定律，存活、可育、外观及生长无异常。结论：小鼠 Atg9b 截短不致死，未产生明显全身表型。
3.7. Histological Observations in Human and Mouse Placenta
人足月胎盘免疫组化示 ATG9B 蛋白在细胞滋养层中等表达、在合体滋养层强表达。小鼠 E18.5 dpc 胎盘蜕膜、交界区及迷路区宽度在 WT/KI 与 KI/KI 间无显著差异。结论：ATG9B 截短不影响小鼠胎盘大体组织结构。
3.8. Comparison of Gene Expression
小鼠胎盘 Atg9b 表达随孕周增加（12.5→18.5 dpc），KI/KI 胎盘 Atg9b 略低但合体滋养层分化相关基因 Gcm1、SynA、SynB、Cebpa 的表达时相变化与 WT/KI 一致。结论：ATG9B 截短不影响小鼠胎盘合体滋养层分化标志基因的转录程序。
3.9. Behavioral Studies
KI 小鼠 OFT、NOR、NLR、社会偏好及埋珠测试与 WT 无差异；被动回避测试中 KI 小鼠进入暗室的潜伏时间有缩短趋势（p=0.08），提示杏仁核依赖的恐惧记忆轻度受损。结论：Atg9b 截短小鼠未重现人患者智力障碍等神经表型，仅在恐惧记忆上有减弱趋势。
四、讨论与结论总结
讨论指出，Family 1 和 Family 3 的移码变异致 C 端平台（C-terminal platform, CTH1–5）缺失，破坏 ATG9B 同源三聚体组装及脂质翻转酶（Lipid Scramblase）活性，截短蛋白不稳定且为功能丧失（Loss-of-Function, LoF）；Family 2 的 p.Gly566Arg 位于跨膜螺旋 4，可能影响三聚体化亦为 LoF。人 ATG9B 特异高表达于胎盘，但小鼠 Atg9b 胎盘表达较低且可被 Atg9a 补偿，加之人鼠脑及胎盘发育差异，致使 KI 小鼠未再现人类神经发育表型。gnomAD 中 ATG9B LoF 耐受性较高（pLI=0.00），提示胎盘特异性功能背景依赖性强，轻型病例可能未被收录。
结论翻译：研究人员提出本文所报道的 ATG9B 双等位基因变异在人类中为致病性，引起常染色体隐性遗传神经发育疾病。截短 ATG9B 蛋白（Family 1）在哺乳动物细胞中不稳定。鉴于本研究的近亲婚配队列背景及群体数据库中 ATG9B 对 LoF 变异的高耐受性，解读需谨慎；确认 ATG9B 为致病基因尚需全球临床界在更多（尤其非近亲）家系中发现同类变异。虽然小鼠模型未出现明显表型可能源于物种特异性表达差异、胎盘发育区别及 ATG9A 代偿等因素，但未来可采用高级哺乳动物模型或类器官进一步解析 ATG9B 在人神经发育中的体内功能。
