冷冻电镜揭示PCDH15（原钙黏素15）呈右手双螺旋二聚体构象

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Cryo-EM reveals a right-handed double-helix dimer architecture of PCDH15

　　

顶端连接（tip link）连接内耳机械感觉毛细胞（hair cell）的静纤毛（stereocilia），并将力传递至机械转导（mechanotransduction，MET）通道。顶端连接由原钙黏素15（protocadherin 15，PCDH15）和钙黏蛋白23（cadherin 23，CDH23）组成，组装成约150 nm长的胞外细丝。罕见的冷冻蚀刻电镜（electron microscopy，EM）图像提示顶端连接在体内可能呈右手双螺旋，但缺乏直接结构证据。研究人员利用冷冻电镜（cryo-electron microscopy，cryo-EM）解析了PCDH15胞外结构域大部分区域的结构。两个PCDH15分子形成平行顺式二聚体（parallel cis dimer），由多个二聚化界面稳定，包括两个链交叉（strand crossovers）和两个平行接触，产生右手双螺旋。功能研究表明PCDH15二聚化结构域内的突变会损害机械转导（MET）。研究人员的结果确立了PCDH15如何形成右手双螺旋以实现机械感觉的分子基础。

论文发表于《Proceedings of the National Academy of Sciences》，研究背景为：内耳脊椎动物毛细胞通过顶端连接（tip link）将机械刺激转化为电信号，顶端连接由PCDH15（原钙黏素15）与CDH23（钙黏蛋白23）组成异源细丝，长约150 nm；此前冷冻蚀刻EM曾提示顶端连接可能为右手双螺旋，但缺乏直接结构证据，且PCDH15较长胞外域（含多个EC重复域及膜旁非经典域如PICA）的整体高级结构未知，单个EC片段晶体结构无法揭示全局螺旋组织，全长分子柔性大也阻碍冷冻电镜解析。研究人员开展本研究以直接用冷冻电镜解析PCDH15胞外大片段的三维结构，明确其二聚体组装方式与螺旋构象，鉴定二聚化界面，并通过突变与毛细胞功能 rescue 实验验证这些界面对机械转导（MET）的作用。结论为：PCDH15 EC1–EC7形成平行顺式同源二聚体，呈右手双螺旋，由EC2–EC3与EC6–EC7链交叉及EC4–EC5平行侧向接触等界面稳定；突变这些界面的残基虽不完全 abolish二聚化但削弱相互作用，且在PCDH15缺陷毛细胞中无法完全恢复MET响应，证明这些侧向二聚化界面对顶端连接正常功能至关重要；该结构与前人活体冷冻蚀刻图像一致，为顶端连接作为门控弹簧（gating spring）的分子力学提供了结构基础，论文意义在于首次在近原子分辨率确立PCDH15右手双螺旋二聚体架构并关联功能。

主要关键技术方法：研究人员使用HEK293F/Expi293F细胞表达小鼠PCDH15片段（EC1–7，EC1–PICA）及CDH23 EC1–3，经Strep-tag或FLAG-tag亲和纯化与尺寸排阻色谱（SEC）验证二聚及异源结合；在3 mM Ca²⁺条件下制备冷冻电镜样品（Titan Krios 300 kV，Falcon 4i探测器），通过CryoSPARC进行颗粒挑选、2D/3D分类与重构，整体分辨率~3.8 ?，局部精修达3.4–3.8 ?；用已有X射线结构刚性拟合电镜图，ISOLDE、Coot、Phenix实空间精修模型；设计缺失与丙氨酸点突变（EC5 Δ598-609、EC6 Δ710-720、EC7 Δ801-809及对应Ala扫描），在HEK293做共免疫沉淀（co-IP）评估二聚化；将全长PCDH15-CD2野生型与点突变质粒连同G-CaMP3通过injectoporation（注射电穿孔）导入Pcdh15缺陷Ames waltzer（av3J/av3J）小鼠生后P2–P3耳蜗外毛细胞（OHC），培养1–2天后免疫荧光定位PCDH15-HA至静纤毛，用流体喷射（fluid jet）刺激毛束并记录GCaMP3荧光钙响应以定量MET恢复；样本队列为小鼠来源重组蛋白与av3J突变体毛细胞。

Results

Analysis of the Structure of the Extracellular PCDH15 Domain Using Cryo-EM.：研究人员构建PCDH15-EC1–7（aa 1–824）与PCDH15-EC1–PICA（aa 1–1381），纯化后SEC显示单体峰且与CDH23-EC1–3混合后出现早洗脱复合峰，表明正确折叠与结合能力；冷冻电镜中EC1–PICA构象不均一但呈二聚交叉“尾”状，EC1–7获得良好分布二聚颗粒，重构整体~3.8 ?（EC1–EC2局部3.43 ?，EC3–EC5 3.40 ?，EC6–EC7 3.83 ?）；二聚体跨度约320 ?，直径~120 ?，呈右手双螺旋一圈，N端为剪刀状链交叉分离（EC2–EC3），其余EC沿纵轴扭转编织，EC1–PICA可见PICA域球状密度而EC1–7无。

Domain Fitting and Analysis of the PCDH15 Dimer Interface.：将已解析X射线结构（EC1–EC6及各单域）刚性拟合电镜图，EC7部分拟合；鉴定三个侧向二聚界面：已知EC2–EC3交叉（此前晶体已见），新发现EC4–EC5近平行对齐（EC4环区与EC5 β-sheet参与），EC6–EC7交叉；膜旁PICA域既往报道有侧向作用，加上本结构共多个界面稳定螺旋二聚体。

Identification of Mutations That Disrupt PCDH15 Dimerization.：研究人员构建EC5（Δ598-609、598-609→Ala）、EC6（Δ710-720、708-715→Ala保留Ca²⁺结合残基）、EC7（Δ801-809、801-808→Ala）突变，在HEK293中用FLAG标签PCDH15-EC1–PICA共表达HA标签缺失/点突变同片段，co-IP加Western blot显示所有缺失与Ala点突变均显著降低EC1–PICA间共沉淀效率；同样Ala点突变在EC1–7片段也减弱二聚化；但在全长PCDH15-CD2背景下单界面Ala突变co-IP无明显影响，说明多界面冗余且跨膜（TM）与胞质域（CTD）也贡献稳定。

Mutations That Disrupt PCDH15 Homodimerization Impair MET in Cochlear Hair Cells.：研究人员将全长WT与Ala点突变PCDH15-CD2-HA加G-CaMP3 injectoporate进av3J小鼠耳蜗OHC，免疫荧光确认突变体仍能转运至静纤毛且表达量可比野生型；流体喷射刺激（0.1、0.3、0.5 s）显示av3J本身无MET响应，WT rescue出强GCaMP3峰值，而EC5（598-609→Ala）与EC7（801-808→Ala）突变体OHC响应显著减弱，EC6（708-715→Ala）变异大但趋势降低；说明削弱EC4–EC5与EC6–EC7侧向二聚界面损害PCDH15在MET中功能。

讨论部分总结：研究人员指出冷冻电镜解析的PCDH15 EC1–7右手双螺旋二聚体与前人活体冷冻蚀刻顶端连接图像一致，推测该螺旋可能延伸至CDH23形成多圈螺旋；除文献已知EC2–EC3界面，新鉴定EC4–EC5（平行）与EC6–EC7（交叉）侧向接触，加上膜旁PICA域相互作用，多界面协同稳定螺旋二聚体以承受顶端连接机械负荷；EC6–EC7交叉在本结构首现，既往EC8–PICA片段无此交叉可能与拆分构象有关，提示该交叉限制两链分离；功能上单界面突变对全长PCDH15 co-IP影响小（冗余），但在isolated EC1–7削弱二聚且毛细胞内不全恢复MET，证明胞外侧向界面与TM/CTD共同关键；研究局限是毛细胞为新生期（技术所限），但MET通道由顶端连接门控故缺陷主要归结构异常；顶端连接具Ca²⁺依赖刚性/柔性交替（某些EC linker结合1–2个Ca²⁺或无），螺旋双链可能提供弹簧特性，交叉增强抗张、柔性区允许可控顺度；该结构为后续分子动力学模拟门控弹簧参数提供约束。结论译为：研究人员在此提供对PCDH15结构与功能的见解。冷冻电镜分析显示PCDH15前七个EC重复组装成右手双螺旋同源二聚体。此架构与先前体内毛细胞顶端连接的电镜图像高度吻合，提示顶端连接由两链紧密互绕螺旋组成。结构揭示多个二聚化界面：除已报道EC2–EC3 linker接触，新鉴定EC4–EC5与EC6–EC7侧向接触；EC4–EC5源于两原体近平行对齐，链在EC2–EC3与EC5–EC6 linker处交叉，两交叉产生右手螺旋使中间EC域紧密对齐；生化实验提示EC4–EC5交叉与平行接触有助于稳定螺旋二聚体；膜旁PICA域侧向作用既往已知，共同表明PCDH15二聚化由多个不同界面介导，可能在顶端连接受力下协同稳定螺旋二聚体；功能数据显示二聚化对PCDH15在MET中作用很重要；尽管冷冻电镜分辨率不能直接观察侧链互作但足以定位互作面以靶向诱变；单二聚界面突变对全长PCDH15 co-IP影响有限暗示多接触冗余，而在EC1–7片段同种突变明显削弱但不废除二聚，符合多界面加和稳定；引入全长PCDH15并在PCDH15缺陷小鼠毛细胞表达，突变体能转运至静纤毛但无法完全恢复MET，表明胞外域侧向互作对正常顶端连接功能至关重要，且跨膜（TM）与胞质域（CTD）也稳定PCDH15同源二聚体；该结果纳入顶端连接力学框架，顶端连接被提议为MET通道门控弹簧，近期光镊实验支持PCDH15力学具Ca²⁺依赖与受限去折叠，螺旋结构进一步提出二聚可作弹簧样分子，交叉在应变下提供机械增强防链分离，Ca²⁺配体较少区允许可控柔顺，两链紧密侧向对齐可能减少弯曲并沿顶端连接高效传力；PCDH15是否在体内采取弯折构象仍不确定（体外可见但或无机械负荷相关）；总结为研究人员描述PCDH15右手螺旋二聚体架构，鉴定两个此前未认识的侧向二聚区，并提供证据表明这些侧向互对于PCDH15在MET中作用必不可少；结构数据为未来模拟提供约束参数。