《Forests》：Associations Between Plant Community Structure and Carbon Sink Capacity in Urban Parks: Taking Tianjin, China, as an Example
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松萎蔫病（pine wilt disease）对松林健康构成严重威胁，亟需高效的生物防治剂。贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis，简称B. velezensis）YG4-2是一株松树内生菌，对松材线虫（Bursaphelenchus xylo
松萎蔫病（pine wilt disease）对松林健康构成严重威胁，亟需高效的生物防治剂。贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis，简称B. velezensis）YG4-2是一株松树内生菌，对松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）具有强杀线虫（nematicidal）活性，但氧条件对其活性的影响尚不清楚。本研究研究人员比较了YG4-2在有氧（aerobic）与厌氧（anaerobic）条件下的生长、杀线虫活性及胞外代谢物谱。有氧培养显著增加了菌体生物量，并增强了菌液及无细胞上清液（cell-free supernatant）的杀线虫活性。基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的非靶向代谢组学（untargeted metabolomics）显示两种氧条件下代谢谱存在明显差异，有氧条件下有19种代谢物显著上调。活性验证表明，犬尿烯酸（kynurenic acid）在所测候选代谢物中杀线虫活性最强。靶向LC-MS/MS进一步证实犬尿烯酸在有氧培养上清液中富集，估算浓度为0.38 ng/mL，而厌氧条件下未检测到明显信号。结果表明，氧通过促进贝莱斯芽孢杆菌YG4-2的生长及调控胞外代谢物（特别是犬尿烯酸）的产生来增强其杀线虫活性，犬尿烯酸是潜在的氧响应活性代谢物。
《Forests》刊载研究解读：氧条件调控贝莱斯芽孢杆菌YG4-2代谢及犬尿烯酸介导的松材线虫杀线虫活性研究
松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）是极具破坏性的森林病原物，引发松萎蔫病（pine wilt disease），造成巨大生态与经济损害。现行防控依赖物理措施和化学杀线虫剂（nematicide），前者成本高且难大面积推广，后者易导致线虫耐药、环境污染及非靶标生物毒害。贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis，B. velezensis）作为益生微生物可产抗菌脂肽（lipopeptide）、聚酮类化合物（polyketide）、水解酶及挥发性有机物（VOC），并能诱导植物系统抗性，已被证实对B. xylophilus具杀线虫（nematicidal）活性，但其关键活性代谢物及调控机制不明。氧是影响微生物生长与次级代谢（secondary metabolism）的重要环境因子，可改变B. velezensis生物量及抗菌脂肽合成，但是否影响其对松材线虫的杀线虫活性及相关代谢调控尚无报道。为此，研究人员以分离自松树内生的B. velezensis YG4-2为对象，对比有氧与厌氧培养下的生长、杀线虫效力及胞外代谢组差异，筛选并验证关键活性代谢物，为松萎蔫病生防菌发酵工艺优化与机理解析提供理论依据。本研究发表于MDPI期刊《Forests》。
主要关键技术方法
研究人员采用B. velezensis YG4-2（GenBank登录号PZ413741）与实验室保藏松材线虫SX01株，分别进行有氧（28 ℃、220 rpm、TSB培养基）与厌氧（氮置换密封、同等温振）72 h培养。测定OD600评估生长；通过浸泡法（soaking assay）检测原始及OD600校正后菌液和0.22 μm滤过无细胞上清液对线虫的校正死亡率；收集8次生物学重复上清进行LC-MS/MS非靶向代谢组学分析（Waters UPLC-Q Exactive，正负离子模式，Compound Discoverer处理，VIP≥1、FC≥1.2或≤0.83、q<0.05筛差异代谢物）；选购有氧上调且有潜在活性代谢物标准品做梯度浓度杀线虫验证；对活性最强候选物行三重四极杆LC-MS/MS靶向MRM验证及外标定量。
3.1. 不同氧条件下B. velezensis YG4-2的生长与杀线虫活性
有氧组OD600达0.70，显著高于厌氧组0.31（p < 0.001）。原始有氧菌液对松材线虫致死率显著高于厌氧菌液（p < 0.001）；将两组调至相同OD600后，有氧组仍具更高杀线虫活性（p < 0.001），表明差异不单纯源于菌体密度。20%无细胞上清液测试中，有氧上清杀线虫活性亦显著高于厌氧上清（p < 0.01）。结论：有氧条件通过促进菌体增殖及分泌胞外活性代谢物共同增强YG4-2杀线虫能力。
3.2. 有氧与厌氧条件下YG4-2培养上清液的代谢组学特征
正负离子模式分别检出5639和2823个化合物，注释1119和694个，分配KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路342和325个。PLS-DA（偏最小二乘判别分析）得分图显示有氧与厌氧样本明显分离，证明氧条件引起胞外代谢谱系统性改变。
3.3. 有氧与厌氧条件下YG4-2培养上清液的代谢组学差异
按VIP≥1、FC阈值及q<0.05筛选，正离子模式得973个差异代谢物（595个有氧上调），负离子模式得588个（378个有氧上调）。KEGG富集主要涉及非核糖体肽（nonribosomal peptide）结构、萘降解、嘧啶代谢、双组分系统（two-component system）、嘌呤代谢等通路，说明氧调控B. velezensis次级代谢相关途径。
3.4. 具潜在杀线虫活性差异代谢物的筛选与活性验证
从有氧显著上调且具注释的19个代谢物中，选取犬尿烯酸（kynurenic acid）、托品醇（tropine）、S-苹果酸（S-malic acid）、香草醇（vanillyl alcohol）、茉莉酸（jasmonic acid）、马尿酸（hippuric acid）、4-氨基苯酚（4-aminophenol）及肉桂醛（cinnamaldehyde）做标准品杀线虫测试。结果犬尿烯酸活性最强（LC50＝9.173 ng/mL），肉桂醛（LC50＝39.09 ng/mL）与4-氨基苯酚（LC50＝47.51 ng/mL）次之，其余LC50＞100 ng/mL或无浓度依赖效应。犬尿烯酸、肉桂醛、4-氨基苯酚被选作靶向验证对象。
3.5. 候选差异代谢物的靶向LC-MS/MS验证
靶向MRM检测显示，犬尿烯酸在有氧上清中出现与标准品保留时间一致的明显色谱峰，厌氧上清及TSB空白对照无信号；外标曲线（R2＝0.9997）估算有氧上清中犬尿烯酸浓度约0.38 ng/mL。肉桂醛与4-氨基苯酚在上清中未检出。结论：犬尿烯酸是有氧条件下B. velezensis YG4-2特异性积累的杀线虫相关代谢物。
讨论与结论翻译
讨论指出，氧促进YG4-2生长及胞外活性代谢物合成，代谢差异富集于非核糖体肽及嘌呤/嘧啶代谢等通路。犬尿烯酸为色氨酸（tryptophan）经犬尿氨酸（kynurenine）途径产物，本研究首证其对B. xylophilus的直接杀线虫作用并可被氧诱导积累，但其可能与其它氧调控代谢物协同发挥作用。肉桂醛与4-氨基苯酚亦展现强杀线虫活性，但未在本发酵上清确认存在，需进一步验证其实际贡献。研究揭示氧可用性是通过代谢重塑增强B. velezensis生防潜力的关键因子，犬尿烯酸是候选氧响应活性代谢物，为优化发酵条件及松萎蔫病绿色防控提供依据。
结论：本研究证明氧可用性是调控贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）YG4-2生长、胞外代谢及对松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）杀线虫（nematicidal）活性的重要因素。有氧条件促进菌体生长并增强菌液及培养上清液杀线虫活性。代谢组学分析与活性验证进一步表明，氧依赖的代谢变化与活性代谢物产生密切相关。在所测候选化合物中，犬尿烯酸（kynurenic acid）表现出最强杀线虫活性，且经靶向LC-MS/MS确认为有氧培养上清液中富集的代谢物。这些发现为贝莱斯芽孢杆菌YG4-2代谢介导的松材线虫杀线虫活性提供了新认识，并为优化其用于松萎蔫病生物防治的发酵条件提供支持。
