多级微纳米生物系统通过协同抑制神经炎症与调控肠脑轴预防脓毒症相关脑病

《Bioactive Materials》：A multistage micro-nano biosystem prevents sepsis-associated encephalopathy through coordinated neuroinflammation suppression and gut-brain axis modulation

　　

研究人员成功构建了一种微藻-纳米粒子多级生物系统CV@MT-NPs，该系统通过静电组装方式将负载褪黑素（melatonin, MT）的季铵化壳聚糖修饰脂质体纳米粒子（MT-NPs）锚定于小球藻（Chlorella vulgaris, CV）表面。所构建的CV@MT-NPs实现了褪黑素的持续释放，显著延长了系统循环时间和脑部滞留时间。在脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导的小鼠脓毒症相关脑病（sepsis-associated encephalopathy, SAE）模型中，CV@MT-NPs显著提高了存活率，减轻了认知功能障碍和焦虑样行为，降低了临床严重程度评分，并缓解了体重下降。机制研究表明，从CV@MT-NPs释放的MT-NPs进入脑内后，通过恢复紧密连接蛋白和重建星形胶质细胞-内皮细胞偶联保护血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）完整性；通过抑制小胶质细胞过度活化、促进小胶质细胞稳态、减轻星形胶质细胞增生反应以及保护线粒体结构和功能来抑制神经炎症。此外，MT-NPs还通过抑制NF-κB信号通路改善全身炎症反应、恢复肠道屏障完整性并促进M2型巨噬细胞极化。值得注意的是，CV组分通过富集有益产短链脂肪酸（short-chain fatty acids, SCFAs）细菌，同时提高肠道和脑内乙酸、丙酸和丁酸水平，在肠道微生物群再平衡中发挥了补充作用。全面的生物相容性评估显示该系统无急性或慢性毒性证据。综上所述，CV@MT-NPs代表了一种多功能、可调控肠脑轴的治疗平台，在预防性给药时展现出同时改善中枢神经病理和外周免疫代谢功能障碍的显著潜力，为SAE提供了一种有前景的预防策略。

脓毒症相关脑病（sepsis-associated encephalopathy, SAE）是由全身性感染引发的严重神经系统并发症，其发病率和死亡率居高不下，给全球公共卫生带来沉重负担。SAE的病理生理机制复杂，涉及全身炎症反应、免疫失调、血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）功能障碍以及神经炎症级联反应等多重环节。近年来，肠脑轴（gut-brain axis）在SAE发病和进展中的关键作用日益受到重视——肠道屏障功能受损和肠道菌群失调可促进病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns, PAMPs）和损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns, DAMPs）的易位，进而放大全身炎症并加剧神经炎症和神经元损伤。然而，现有治疗策略多为支持性治疗，尚缺乏能够同时靶向神经炎症和肠道菌群失调的特异性药物干预手段。

褪黑素（melatonin, MT）作为一种内源性激素，具有强大的抗氧化、抗炎和神经保护作用，但其在SAE患者体内水平显著降低，且外源性补充面临生物利用度差、系统清除快、脑穿透有限等药代动力学挑战。与此同时，微藻作为天然生物材料，富含多糖、蛋白质、脂质等生物活性成分，具有抗炎、抗氧化、免疫调节及肠道菌群调控等多重功能，但其治疗潜力尚未在SAE领域得到充分挖掘。基于上述互补机制，研究人员假设将缓释褪黑素与微藻的肠道修复及菌群调节功能相结合，有望通过脑-肠双靶点协同干预SAE。为此，研究人员构建了CV@MT-NPs这一多功能治疗平台，并成功发表于《Bioactive Materials》杂志。

该研究采用的主要关键技术方法包括：薄膜水化法制备脂质体，静电组装构建微藻-纳米粒子复合系统；动态光散射（dynamic light scattering, DLS）、透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）、扫描电子显微镜（scanning electron microscope, SEM）、傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR）及紫外-可见-近红外光谱（UV-Vis-NIR spectroscopy）进行材料表征；体外透析法评估药物释放动力学；Cy7荧光标记结合离体成像及酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）分析药代动力学和脑分布特征；LPS诱导的C57BL/6小鼠SAE模型（低剂量2 mg/kg用于行为和神经病理评估，高剂量15 mg/kg用于生存分析）；Y迷宫、旷场、新物体识别等行为学测试评估认知和情绪功能；Evans blue渗漏实验、TEM及免疫荧光染色评估BBB完整性；IBA1、SALL1、GFAP等免疫荧光及流式细胞术分析神经炎症和胶质细胞活化状态；脑组织及血清炎症因子ELISA检测和实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）分析炎症相关基因表达；TEM观察线粒体超微结构；H&E染色和TUNEL染色评估外周器官损伤；流式细胞术分析腹腔巨噬细胞表型；Western blot检测NF-κB通路蛋白磷酸化水平；16S rRNA基因测序分析肠道菌群组成；气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS）定量粪便和脑组织SCFAs；Transwell共培养体系建立体外BBB模型；CCK-8细胞毒性实验、血清炎症因子检测、长期组织病理学及血液学分析评估生物相容性。

**CV@MT-NPs的合成与表征。** 研究人员通过静电组装将带正电的MT-NPs锚定于带负电的CV表面，成功构建了CV@MT-NPs多级生物系统。TEM显示MT-liposomes为单室球形结构，而引入季铵化壳聚糖后形成的MT-NPs呈现多室层状结构。DLS分析表明MT-NPs在4°C的ddH₂O中至少稳定30天。当MT浓度为200 μg/mL时，CV的药物负载效率达到峰值。Zeta电位测定证实了CV（负电位）、MT-NPs（正电位）及CV@MT-NPs（正电位）的电荷转变，验证了静电组装的成功。SEM和CLSM显示MT-NPs均匀分布于CV表面。药物释放实验表明，CV@MT-NPs较MT-NPs具有更缓慢的释放速率，归因于CV表面滞留的纳米粒子形成了额外的扩散屏障。

**CV@MT-NPs实现褪黑素的持续释放和脑部延长滞留。** 药代动力学研究显示，游离MT的系统半衰期（T_1/2）仅为0.67 ± 0.26 h，而MT-NPs和CV@MT-NPs分别延长至1.45 ± 0.41 h和2.91 ± 0.40 h；CV@MT-NPs的曲线下面积（area under the curve, AUC_0-∞）达2979 ± 301.25 h×pg/mL，显著高于游离MT和MT-NPs。Cy7荧光示踪显示，CV@MT-NPs在脑内的荧光信号可持续至24 h，脑积累量比MT-NPs高约1.5倍（8 h和12 h时）；ELISA证实CV@MT-NPs组脑内褪黑素浓度在8 h时显著高于其他组。系统分布显示各制剂主要蓄积于肝脏和脾脏，CV@MT-NPs在肝脏和脾脏的滞留时间延长。CV载体本身不跨越BBB，仅作为艾叶告辞作为稳定载体调节MT-NPs的释放动力学。

**CV@MT-NPs改善SAE小鼠认知和焦虑样行为及整体预后。** 行为学测试显示，CV@MT-NPs显著恢复了LPS诱导的小鼠Y迷宫自发交替行为缺陷，改善了旷场实验中的不动时间和总移动距离（虽在中心区域时间有改善趋势但统计学未达显著），并显著提高了新物体识别实验中的识别指数。临床评估方面，CV@MT-NPs将小鼠脓毒症严重程度评分（murine sepsis severity score, MSS）从LPS组的7.7 ± 0.61降至5.8 ± 0.82，有效阻止了体重下降，并将48 h存活率从25%提升至75%。值得注意的是，口服灌胃给药未能提供显著生存获益，强调了肠外给药的重要性。

**CV@MT-NPs增强BBB完整性并减轻神经血管损伤。** TEM超微结构分析显示，CV@MT-NPs组恢复了接近正常的BBB结构，包括连续的紧密连接、完整的内皮细胞和正常的星形胶质细胞足突附着。Evans blue渗漏实验定量显示CV@MT-NPs组脑内染料含量（5.86 ± 1.83 μg/g）接近对照组（0.232 ± 0.096 μg/g），显著低于LPS组（22.8 ± 6.46 μg/g）。免疫荧光显示CV@MT-NPs恢复了AQP4与CD31的共定位以及ZO-1的连续表达，表明其促进了神经血管单元的重建和紧密连接完整性。

**CV@MT-NPs抑制神经炎症并保护脑损伤。** 免疫荧光显示CV@MT-NPs显著降低皮层、CA1海马和齿状回（dentate gyrus, DG）的IBA1荧光强度和IBA1⁺细胞数量，并恢复SALL1表达水平，提示小胶质细胞从过度活化状态恢复至稳态。CLSM三维重建证实小胶质细胞形态从活化型（胞体增大、突起简化）恢复至监视型（胞体较小、突起分支复杂）。CV@MT-NPs还显著降低GFAP荧光强度，减轻星形胶质细胞增生。ELISA和qRT-PCR显示脑内IL-6、TNF-α、IL-1β、COX2、iNOS等促炎因子显著下调，MDA水平降低。TEM显示CV@MT-NPs有效保护了线粒体超微结构，减少肿胀、嵴紊乱和电子密度降低等损伤表现。

**CV@MT-NPs保护肠道屏障功能并缓解全身炎症。** CV@MT-NPs恢复血清褪黑素至接近正常水平。H&E染色显示其显著改善小肠组织病理，免疫荧光证实occludin和claudin-1表达恢复。流式细胞术分析腹腔巨噬细胞显示，CV@MT-NPs有效逆转了LPS诱导的F4/80⁺CD11b⁺细胞耗竭，并显著促进M2型极化（CD206⁺增加，CD86⁺减少），效果优于单一组分。血清IL-6和TNF-α水平显著降低。体外LPS刺激Raw 264.7巨噬细胞实验表明，MT-NPs和CV@MT-NPs抑制NO产生、下调促炎基因并上调Arg1，Western blot证实CV@MT-NPs对p65磷酸化抑制最强。所有制剂均降低细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平。

**CV@MT-NPs恢复肠道菌群稳态并通过SCFA介导的信号调控肠脑轴。** 16S rRNA测序显示CV@MT-NPs改变了肠道菌群β多样性结构，尽管α多样性无显著变化。CV@MT-NPs减少潜在致病菌Escherichia-Shigella和Akkermansia的丰度，富集Faecalibaculum和norank_f_Muribaculaceae等有益菌。GC-MS分析显示CV@MT-NPs显著提高粪便中乙酸、丙酸和丁酸浓度，同时降低支链脂肪酸异戊酸水平；这些变化在脑组织中同样得到验证，脑内乙酸、丙酸和丁酸升高而异戊酸降低。Spearman相关性分析揭示Escherichia-Shigella与血清LPS及异戊酸正相关，与乙酸、丙酸和丁酸负相关。SCFA补充实验证实其可缓解神经炎症和胶质细胞过度活化。伪无菌小鼠模型显示肠道菌群耗竭显著削弱CV@MT-NPs的神经保护作用，证实肠道菌群对其完整疗效的必要性。

**体外验证CV@MT-NPs的多层次神经保护机制。** Transwell bEnd.3-BV-2共培养体系显示，MT-NPs有效维持跨内皮电阻（transendothelial electrical resistance, TEER）、降低FITC-葡聚糖通透性，抑制bEnd.3细胞的促炎基因表达。MT-NPs以时间依赖性方式跨内皮转运，被BV-2小胶质细胞内吞后逐渐向溶酶体转运。MT-NPs显著降低BV-2细胞IL-6、TNF-α、NO和ROS水平，促进CD86下调和CD206上调的表型转换。SCFAs处理直接抑制小胶质细胞炎症反应。在BV-2-HT22共培养体系中，MT-NPs显著减少神经元凋亡，保护线粒体网络结构，提高线粒体膜电位（JC-1红色聚集体/绿色单体比值）。

**CV@MT-NPs的生物相容性评估。** CCK-8实验显示CV、MT、MT-NPs和CV@MT-NPs在0-80 μg/mL浓度范围内对Raw 264.7和bEnd.3细胞均无显著毒性。血清炎症因子动态监测显示给药后3、8、24和48 h无急性炎症反应。14天长期给药后，心、肝、脾、肺、肾的H&E染色未见病理改变，血液学参数（WBC、RBC、NEU%、LYM%、MON%、HGB、PLT、MCV）无显著异常。CV的叶绿素自发荧光示踪显示，腹腔巨噬细胞对CV的摄取在12 h达峰（52.4%），48 h降至2.46%；腹膜灌洗液UV-Vis-NIR光谱和荧光强度呈时间依赖性衰减，证实CV经巨噬细胞吞噬后酶解降解，具有良好的生物可降解性。

**讨论与结论。** 研究人员开发的CV@MT-NPs作为一种仿生多功能药物递送系统，通过CV与MT-NPs的协同作用，实现了对SAE的脑-肠双靶点干预。MT-NPs介导中枢保护效应：通过恢复紧密连接蛋白和星形胶质细胞-内皮细胞偶联保护BBB完整性，通过抑制小胶质细胞过度活化和减轻星形胶质细胞增生反应抑制神经炎症，通过保护线粒体结构和功能减轻神经元损伤。同时，MT-NPs通过抑制NF-κB信号通路、促进M2型巨噬细胞极化和恢复肠道屏障完整性改善外周免疫代谢功能障碍。CV组分则通过富集产SCFA细菌和提升肠道及脑内乙酸、丙酸、丁酸水平，主动重塑肠道微生物群，强化肠脑轴通讯，放大全身抗炎和神经保护反应。CV与MT-NPs的协同作用不仅优化了褪黑素的药代动力学和生物分布，还实现了脑、肠、免疫系统等多器官协调保护。严格的生物相容性评估证实该系统无急性或慢性毒性，CV可通过巨噬细胞介导的吞噬作用安全清除和降解。

研究结论指出：CV@MT-NPs作为一种安全、可生物降解且高效的SAE预防策略，其中MT-NPs和CV协同作用，同时靶向中枢神经病理和外周功能紊乱。这种双效平台对于治疗其他根植于肠脑轴紊乱的炎症性疾病也具有重要意义。然而，该研究采用的预防性给药策略虽可最大化治疗效应，但临床转化面临实际挑战，可能更适用于明确的高危人群（如大手术、严重创伤或免疫功能低下患者）。未来需在大型动物模型中进行重复给药研究，以全面评估治疗效应、生物降解性和长期安全性。