帕金森病细胞模型中LRRK2（富亮氨酸重复激酶2）与PP2A（蛋白磷酸酶2A）信号之间的调控关系

《Biochemical Journal》：Regulation between LRRK2 and PP2A signaling in cellular models of Parkinson’s disease

　　

富亮氨酸重复激酶2（LRRK2）突变是迄今已知晚发性家族性及特发性帕金森病（PD）最常见的病因。重要的是，近期来自死后组织及生物标志物研究的数据表明，即使不存在突变，LRRK2激酶活性升高在特发性PD发病机制中也发挥重要作用。尽管对LRRK2已有广泛研究，其激活机制以及各种突变如何导致激酶活性升高和神经元死亡仍不完全清楚。越来越多的证据指向LRRK2磷酸化调控（包括自磷酸化及其他激酶介导的磷酸化）是其激活的潜在分子触发因素。LRRK2的激活与亚细胞定位受蛋白磷酸酶1（PP1）和蛋白磷酸酶2A（PP2A）等磷酸酶调节，但这种磷酸化调控的确切机制尚不清楚。研究人员的数据揭示，体外PP2A可使LRRK2的RocCOR?GTPase结构域内的位点去磷酸化，从而破坏LRRK2二聚体稳定性，进而降低其激酶活性。引人注目的是，研究人员的数据进一步强调，LRRK2反过来可磷酸化PP2A全酶催化亚基PPP2CA的关键残基T304。此外，LRRK2介导的PP2CA T304磷酸化会改变C末端的甲基化状态，而该甲基化对全酶组装和催化活性均至关重要。重要的是，WT?PPP2CA的表达能够保护LRRK2?G2019S诱导的神经元细胞死亡，而PPP2CA?T304A突变体则无法实现这种保护作用，表明PP2A全酶组装受损可能对LRRK2相关PD有害。

该研究发表于《Biochemical Journal》（《生物化学杂志》）。研究背景方面，LRRK2突变是晚发性家族性及特发性帕金森病最常见的遗传因素，即便无突变，LRRK2激酶活性异常升高也在特发性PD发病中起关键作用。已有研究表明磷酸酶PP1和PP2A可调控LRRK2的激活与定位，且PP2A与LRRK2的RocCOR串联结构域相互作用并具有神经保护作用，但PP2A调控LRRK2磷酸化及二者相互调控的具体分子机制不清楚，特别是RocCOR结构域内磷酸化位点的去磷酸化酶尚未确定；此外PP2A催化亚基PPP2CA的T304磷酸化及C端甲基化对全酶组装和功能至关重要，但是否受LRRK2调控未知。因此研究人员开展本研究以明确PP2A与LRRK2之间的双向调控关系及其在LRRK2相关PD中的功能意义。

关键技术方法：研究人员采用体外激酶?磷酸酶偶联生化反应、DIA?基于质谱的磷酸化位点鉴定、邻近生物素标记技术纯化LRRK2二聚体并结合ELISA定量二聚化水平与二聚体内源激酶活性检测（使用NICtide底肽）、商业化及自表达重组蛋白的体外实验（HEK293T、A549、RAW264.7细胞系，LRRK2?KO RAW264.7细胞系，原代小鼠胚胎皮层神经元），免疫沉淀与免疫印迹检测磷酸化及甲基化状态，pull?down分析PPP2CA与调节亚基相互作用，Malachite Green法检测PP2A磷酸酶活力，免疫荧光共表达与活化caspase?3/核碎裂法评估神经元死亡，并使用选择性抑制剂（okadaic acid、MLi?2、H1152等）进行功能验证。

研究结果：

PP2A dephosphorylates LRRK2 and regulates its kinase activity in vitro and in cells（PP2A在体外和细胞内去磷酸化LRRK2并调控其激酶活性）：研究人员通过在HEK293T细胞中共表达WT?PPP2CA与LRRK2邻近生物素标记构建对，发现PPP2CA过表达显著降低LRRK2二聚体水平及分离二聚体的NICtide激酶活性；体外用Dictyostelium Roco4激酶预磷酸化LRRK2 RocCOR（aa 1293–1840）片段后加入商业化GST?PPP2CA，western blot证实PPP2CA可特异性降低T1503位点的磷酸化；在A549细胞（用氯喹提升LRRK2活性）及RAW264.7巨噬细胞中，PP2A选择性抑制剂okadaic acid处理使内源性LRRK2 pT1503信号显著上升；LRRK2 T1503A磷酸死突变体自身显示二聚化与激酶活性低于WT，WT/T1503A异二聚体二聚化未明显改变但激酶活性略降。由此得出结论：PP2A可在体外和细胞内去磷酸化LRRK2 RocCOR结构域T1503位点，该位点磷酸化状态影响LRRK2二聚体稳定性及激酶活性。

LRRK2 phosphorylates PPP2CA at T304 and thereby reduces its C?terminal methylation state（LRRK2磷酸化PPP2CA T304并从而降低其C端甲基化状态）：磷酸化质谱发现LRRK2可磷酸化PPP2CA的T304（Thr?Pro模体）；共表达LRRK2?G2019S与NSF?WT?PPP2CA或T304A突变体后pull?down及pThrPro抗体检测显示WT?PPP2CA被磷酸化而T304A信号极低；体外纯化LRRK2与PPP2CA在ATP存在下LRRK2自磷酸化S1292及PPP2CA T304同时发生，加入LRRK2抑制剂MLi?2则无磷酸化；LRRK2?KO RAW264.7细胞中免疫沉淀内源性PPP2CA/PPP2CB的pThrPro信号显著低于WT细胞，A549细胞中MLi?2抑制LRRK2也降低pT304信号；RAW264.7细胞用酵母聚糖（zymosan）激活LRRK2（以RAB8A磷酸化为指标）同时PP2Ac C端L309甲基化水平显著下降，MLi?2处理则有升高趋势。结论：LRRK2是PPP2CA T304的激酶，该磷酸化会降低PPP2CA C端甲基化。

LRRK2 regulates PP2A holoenzyme formation and its catalytic activity（LRRK2调控PP2A全酶组装及其催化活性）：pull?down实验显示T304D?PPP2CA（磷酸模拟）与调节亚基PPP2R2B（B55β1）、PPP2R2A（B55α）的相互作用弱于WT和T304A，而与PPP2R5C（B56γ3）的相互作用在T304A和T304D中均比WT降低；体外磷酸酶活力检测（K?R?pT?I?R?R肽底物，Malachite Green法）表明纯化NSF?WT?PPP2CA活力高于T304A和T304D突变体；原代小鼠胚胎皮层神经元共转染LRRK2?G2019S与WT?PPP2CA时活化caspase?3阳性/核碎裂神经元比例较单独G2019S显著降低，但共转T304A?PPP2CA无保护效果。结论：PPP2CA T304磷酸化状态调控其与调节亚基结合、全酶组装、磷酸酶活力及对抗LRRK2?G2019S神经元毒性的能力。

讨论部分总结：已有研究显示PP1调控LRRK2 N端磷酸簇（S910、S935等），PP2A（与PPP2R2A/B组合）也参与此调控，PPM1H通过去磷酸化LRRK2下游Rab GTP酶拮抗LRRK2功能；本研究人员在体外和细胞模型中确定T1503是LRRK2 RocCOR内受PP2A去磷酸化的位点之一，PP2A过表达或T1503A突变降低LRRK2二聚化与激酶活性，说明该自磷酸化位点通过影响二聚稳定性调控激酶活性。反向地，LRRK2可磷酸化PPP2CA T304，损害C端甲基化、全酶组装和磷酸酶活力。WT?PPP2CA而非T304A能保护LRRK2?G2019S神经元毒性。PP2A活性下调同样见于α?突触核蛋白（αSyn）PD模型，且PD/DLB患者脑内PP2A甲基化降低、甲基转移酶减少、去甲基酯酶升高，常染色体隐性早发性帕金森症伴智力障碍也与PP2A激活受损相关。PP2A还可去磷酸化αSyn S129和Tau，其活性下调也出现在AD中。因此PPP2CA C端调控对PD普遍重要。综上，PP2A在体外可去磷酸化LRRK2（降低二聚化与激酶活性），LRRK2也可磷酸化PP2A催化亚基T304（减少甲基化、全酶组装、磷酸酶活力），形成双向调控回路；促进PP2A全酶组装可能有益于LRRK2相关PD及更广的PD治疗。