用于胶质母细胞瘤干细胞与溶瘤单纯疱疹病毒颅内注射的三次存活立体定向脑手术(Triple-Survival Stereotactic Brain Surgeries for the Intracranial Injections of Glioblastoma Stem-like Cells and Oncolytic Herpes Simplex Viruses)

《Methods and Protocols》：Triple-Survival Stereotactic Brain Surgeries for the Intracranial Injections of Glioblastoma Stem-like Cells and Oncolytic Herpes Simplex Viruses

　　

摘要：胶质母细胞瘤(Glioblastoma, GBM)是一种侵袭性原发性脑肿瘤，预后差且治疗抵抗，亟需可靠的临床前模型来评估新兴疗法。胶质母细胞瘤干细胞样细胞(Glioblastoma Stem-like Cells, GSCs)的原位移植联合治疗剂的瘤内注射，是模拟GBM肿瘤生长及研究治疗反应的常用方法。特别是溶瘤单纯疱疹病毒(oncolytic Herpes Simplex Virus, oHSV)因可选择性靶向恶性细胞、诱导抗肿瘤免疫反应且全身毒性低，已成为一种有前景的治疗策略。然而，对同一动物进行重复存活立体定向神经外科手术存在显著技术挑战。本研究描述了一种全面且可重复的小鼠三次存活立体定向神经外科手术方案，包括：(i) 颅内植入GSCs以建立原位肿瘤；(ii) 使用相同立体定向坐标行oHSV瘤内注射；(iii) 对侧颅内再次给予GSCs以评估治疗效果及对肿瘤再攻击的抵抗能力(作为免疫记忆指标)。应用该方案可实现一致的肿瘤成瘤，小鼠可耐受重复神经外科手术并稳定术后恢复。同一动物成功的颅内再攻击证明了多次存活手术的技术可行性，同时最小化了操作相关变异性和并发症。该方法可在单一实验对象内纵向评估肿瘤进展、治疗反应及持久的记忆保护作用，并为评估GBM的溶瘤病毒疗法及其他局部治疗策略提供了通用平台。

论文解读：用于胶质母细胞瘤干细胞与溶瘤单纯疱疹病毒颅内注射的三次存活立体定向脑手术方案

一、研究背景与立题依据

胶质母细胞瘤(Glioblastoma, GBM)是最常见的原发性恶性脑肿瘤，标准治疗（手术切除、放疗、化疗）后几乎普遍致死。GBM干细胞样细胞(Glioblastoma Stem-like Cells, GSCs)是肿瘤起始、进展、免疫抑制及治疗抵抗的重要驱动因素，因此基于GSCs的原位小鼠GBM模型是评估新型治疗策略的重要平台。溶瘤病毒(Oncolytic Viruses, OVs)，尤其是溶瘤单纯疱疹病毒(oncolytic Herpes Simplex Virus, oHSV，如G47Δ及表达白细胞介素-12的G47Δ-IL12)，可通过直接溶瘤和诱导抗肿瘤免疫反应成为GBM新兴疗法，且有潜力诱导免疫记忆。评估原位GBM模型中的治疗效果和免疫记忆，需要在同一动物体内依次完成肿瘤建立、治疗给药和肿瘤再攻击（对侧再接种），这要求实施重复立体定向神经外科手术。但目前缺乏将颅内肿瘤植入、治疗剂瘤内递送和对侧肿瘤再攻击整合进单一可重复流程的标准化方法。本文发表在《Methods and Protocols》，旨在详细描述这一三次存活立体定向神经外科手术的标准操作流程，解决重复颅脑手术的技术难点。

二、主要关键技术方法概述

研究人员选用7–8周龄C57BL/6小鼠，于生物安全二级(BSL-2)设施内操作。术前24小时通过含卡洛芬(carprofen)的代水凝胶提供术前镇痛，术中腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪(ketamine/xylazine)全身麻醉并在立体定位仪(David Kopf Model 963)上固定，眼部涂抹眼膏防止干燥，头皮碘伏及酒精消毒后皮下注射0.25%布比卡因(bupivacaine)局部麻醉。第一次手术：于前囟(bregma)右侧旁开2.2 mm、前1.0 mm钻0.6 mm骨孔，进针至纹状体深3.0 mm后退0.5 mm，缓慢注射3 μL含2×10⁴GSCs悬液，骨蜡封闭骨孔、5-0尼龙线缝合皮肤。第二次手术（植瘤后约8天）：原切口及骨蜡 reopen，同坐标进针行oHSV（G47Δ-IL12，1×10⁶PFU/3 μL或5×10⁵PFU/2 μL）瘤内注射。第三次手术（长期存活无瘤小鼠）：于前囟左侧（对侧）相同解剖坐标钻新孔并行GSCs再攻击植入。每次术后单笼保温监测至苏醒，持续给予卡洛芬镇痛凝胶及必要时皮下注射卡洛fen，每日监测体重与神经状态，5–7天拆线，达到人道终点（体重丢失≥20%、严重神经症状等）时安乐死。

三、研究结果（按原文小节浓缩）

Experimental Design（实验设计）

研究人员明确了实验需在BSL-2设施中进行，详列了GSCs、oHSV(G47Δ-IL12)、麻醉剂（氯胺酮100 mg/kg+赛拉嗪10 mg/kg腹腔注射）、镇痛剂（0.25%布比卡因局部+卡洛芬口服凝胶10 mg/kg/天）、立体定位仪及配套加热板、微型电钻(0.6 mm钻头)、Hamilton 10 μL注射器与 cemented needle、骨蜡、5-0尼龙缝线等材料，并说明了GSCs悬液（2×10⁴cells/3 μL，多配50%余量防损耗）、oHSV工作液（冰上传送，多配50%余量）、卡洛芬口服凝胶（按笼盒总鼠重计算加药量，60 mL凝胶加2.4 mg卡洛芬）及氯胺酮/赛拉嗪混合麻醉液（按个体体重调整体积）的配制方法。指出成功依赖于准确麻醉、立体定位、控深钻孔、脑实质内准确置针及术后护理，局限包括约1/64小鼠恢复困难、误注入脑室可致成瘤失败、<18 g小鼠不宜入选、钻孔过深致脑膜损伤出血等。

Procedure（操作流程）

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  Pre-Surgery Preparations（术前准备）：术前24 h投喂卡洛芬凝胶；手术日工作台先10%漂白水再70%异丙醇擦拭，预热保温垫；逐只称重；单只小鼠断尾提捏(scruff)后腹腔注射麻醉，脚趾掐捏法确认麻醉深度；生物安全柜同法消毒，安置两台立体定位仪并各放加热垫预热；Hamilton注射器装于万能夹使刻度面朝术者，针尖斜面朝向术者，旋开便于上鼠，同法处理第二台；注射器依次用70%异丙醇、无菌蒸馏水、无菌PBS冲洗并排尽气泡；确认麻醉满意后将小鼠置预热耳棒—插入双侧外耳道至有轻微"咔"感—门齿嵌入齿杆固定，每眼滴一滴润滑眼膏。
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  Preparation of the Surgical Site（术区准备）：以聚维酮碘棉签由中心向外画圆消毒，再用新鲜70%异丙醇棉纱连做三次由中心向外单向擦拭，待干；无必要不剃毛以免微损伤。用1 mL胰岛素注射器在拟切开处(bregma区)提起皮肤，缓慢皮下注射30–50 μL 0.25%布比卡因局部麻醉。
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  First Survival Surgery: Intracranial Implantation of GSCs（第一次存活手术：GSCs颅内植入）：bregma上方作~5 mm正中切口暴露颅骨，拭清血液辨认bregma；确定注射点为bregma右旁2.2 mm、前1.0 mm；0.6 mm钻头仅钻透颅骨不伤及硬脑膜形成骨孔；吸取GSCs前轻弹管底使细胞重悬均匀，Hamilton针吸入3 μL；针尖对正骨孔，先降至于骨孔面（斜面仍可见）再进至脑内3.0 mm，退回0.5 mm，以0.1 μL/s速率缓慢推注(~30 s)，注毕留针≥3 min；以~0.5 mm/12 s速度缓退，针尖用干纱布擦拭防交叉污染；取少量骨蜡封孔，5-0尼龙线间断缝合一切口。
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  Second Survival Surgery: Intratumoral Injection of oHSV（第二次存活手术：oHSV瘤内注射）：术前准备同第一次；植瘤后约8天（依实验设计可调整）沿原切口切开、小心剥离并移除骨蜡暴露原骨孔；oHSV悬液装入注射器排尽气泡，经同一骨孔、相同坐标及深度进针；以1 μL/15 s速率缓慢注射(共~30 s)，注毕留针2–3 min防反流；缓退针，重新骨蜡封孔，同法缝合；术后护理同第一次。
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  Third Survival Surgery: Intracranial Rechallenge with GSCs（第三次存活手术：GSCs对侧再攻击）：术前准备同上；在长期存活无瘤小鼠原术区对侧（bregma左旁2.2 mm、前1.0 mm）作新正中切口、钻孔、按第一次手术步骤植入GSCs（可考虑2–5倍细胞数强化免疫记忆检测），骨蜡封孔并缝合；术后护理同前。
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  Postoperative Care（术后护理）：术毕移入清洁单笼置保温台（热源不直接照射动物），持续观察至完全清醒、能走动；笼内添加新鲜卡洛芬凝胶杯，若见不适体征可追加皮下卡洛芬6 mg/kg/天，必要时选用缓释丁丙诺啡(Ethiqa XR)；术后至少每天两次监测体重、活动、理毛、姿势及神经状态，将饲料置于笼底方便采食；通常5–7天拆除尼龙缝线（小鼠自搔可能提前脱落）。
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  Study Endpoint and Euthanasia Criteria（研究终点与人道终点）：代表性小鼠在预设终点安乐死以评估肿瘤及治疗效价；出现体重丢失≥20%、嗜睡/反应迟钝、癫痫发作/转圈/瘫痪等神经症状、呼吸困难、术区感染不愈等立即安乐死；采用100% CO₂充气舱窒息后辅以颈椎脱臼或开胸确证死亡，死亡本身不作为实验终点。

Expected Results（预期结果）

按此方案操作，第一次手术后应获得高一致性原位成瘤；第二次手术可准确定位并瘤内递送oHSV；经治疗长期存活小鼠第三次对侧GSCs再攻击后应被排斥或明显延迟成瘤，提示诱导出有效抗肿瘤免疫记忆。组织学可验证肿瘤形成及oHSV在注射灶分布。Mock组通常约35天达人道终点。需密切监测疾病进展体征（体重下降≥15%、驼背、活动减少、神经症状等），必要时提供支持护理。长期存活者维持观察至对照组生存期的两倍以上再行再攻击评估，若再攻击后无瘤或生长受抑即功能证实免疫记忆形成。

四、讨论与结论翻译

该三次存活立体定向流程区别于既往单次或双次手术方案，将肿瘤建立、治疗递送及免疫记忆评估整合于同一动物，可在单一个体同时评价原发肿瘤控制与持久抗肿瘤免疫，较分开系统在转化相关性上具显著优势。使用恒定立体定向坐标及复用初次骨孔可减少脑实质扰动与操作变异、促进术后恢复并提高重复性。但重复手术也存在累积手术应激、延长麻醉暴露及局部炎症风险，可能影响肿瘤生物学或免疫应答，解读结果时应予考虑；坐标偏差会增加组织损伤与成瘤/给药不均，须严格标准化操作。瘤内而非全身给予oHSV可提高瘤内药物富集、降低中和抗体及补体灭活影响、限制病毒于肿瘤细胞及微环境内复制扩散，提高安全性，本方案亦可拓展至其他病毒载体、生物制剂或化疗药的颅内给药。原位颅内模型较皮下模型更能重现人脑肿瘤解剖、生理及免疫特征及神经症状演进，故监测以行为生理参数为主而非仅凭瘤体大小。本方案不以死亡为终点，严格执行人道终点与全面围术期镇痛护理最小化痛苦，所述剂量方案下oHSV疗法不良反应罕见。总之，该三次存活立体定向神经外科手术模型为评估GBM新疗法尤其是记忆保护效应提供了强有力且通用的临床前平台，填补了同时评估疗效与免疫记忆的模型空白，可推动开发更长效的脑肿瘤治疗策略。

结论原文浓缩翻译：

该三次存活立体定向神经外科手术方案提供了一个稳健、可重复的平台，用于在单一实验框架内研究GBM进展、治疗反应及长期抗肿瘤免疫。通过整合颅内肿瘤建立、oHSV精确瘤内递送及对侧肿瘤再攻击，可全面评估肿瘤根除与免疫记忆。使用一致的立体定向技术与标准化围术期护理确保高重现性并最小化实验间变异。该模型可适配多种治疗制剂，并可扩展至其他颅内肿瘤体系（如乳腺癌脑转移模型），因而为推进实现GBM及其他脑部恶性肿瘤肿瘤控制与持久免疫保护的疗法开发提供了可扩展且具有转化相关性的平台。