机械应力通过上调整合素亚基αD的表达，减弱了巨噬细胞的代谢重编程及其向M1型极化的过程

《Cellular Signalling》：Mechanical stress attenuates the metabolic reprogramming and M1 polarization of macrophages by upregulating integrin subunit alpha D

　　

张颖|李全|徐世新|罗阳|刘文燕|刘宇

中国昆明医科大学第二附属医院骨科

摘要

我们之前已经证明，一种新型的生长促进系统可以通过改善机械微环境，缓解患有早发性脊柱侧弯合并胸廓发育不全综合征（EOS + TIS）的猪仔的肺发育不良。转录组分析表明，机械应力（MS）可能通过调节免疫反应和代谢途径来发挥作用。在此基础上，本研究进一步探讨了MS对巨噬细胞极化和代谢重编程的影响及其潜在的分子机制。在本研究中，10%幅度的MS有效降低了RAW264.7细胞中的M1型标志物（CD86、IL-1β、iNOS、TNF-α）的水平，同时提高了M2型标志物（TGF-β、CD206、IL-10）的水平。转录组分析进一步表明，MS通过调节糖酵解、代谢重编程和免疫相关途径影响肺发育。进一步的实验表明，MS降低了糖酵解酶（PKM2、GLUT1、PGK1和LDHA）的水平，减少了乳酸的产生和细胞外酸化速率，同时提高了由RAW264.7细胞条件培养基诱导的人脐静脉内皮细胞的管形成能力。从机制上讲，MS通过上调整合素αD亚基（ITGAD）的表达激活了SOCS3/STAT3通路，从而促进了RAW264.7细胞中的M2极化并抑制了糖酵解代谢重编程。ITGAD的敲低逆转了这些效应。总之，MS通过上调ITGAD激活SOCS3/STAT3通路，促进了巨噬细胞向M2表型的极化，抑制了糖酵解代谢重编程，并增强了其促血管生成功能。这一发现揭示了MS在肺微环境中的新机制，为理解EOS + TIS相关肺发育不良的病理过程提供了新的分子视角。

引言

胸椎-肺复合体的正常发育依赖于其结构完整性和机械环境之间的精确协调。在患有早发性脊柱侧弯合并胸廓发育不全综合征（EOS + TIS）的情况下，异常的机械环境会导致进行性肺发育不良，这是患者呼吸衰竭和死亡的主要原因[1]、[2]、[3]。虽然目前的一些生长促进技术可以有效恢复胸腔容积并改善脊柱对齐[4]、[5]，但仍存在一个关键的临床问题：这些干预措施不足以完全逆转已建立的肺发育不良和微血管稀疏。因此，迫切需要阐明植入物介导的机械矫正如何转化为能够重新编程受损肺组织的生物信号。

我们之前的研究建立了一个能够准确再现EOS + TIS临床特征的猪模型，包括脊柱侧弯、胸廓不对称和肺容积减少[6]。我们进一步证明，一种新型的生长促进系统（NGFS）可以有效改善该模型中的脊柱畸形和肺发育不良[7]。转录组分析显示，NGFS可能通过调节与肺免疫微环境、钙离子转运和血管发育相关的途径来发挥作用[6]、[7]。后续研究证实，模拟NGFS的机械应力（MS）通过激活BDKRB1/Ca²⁺/CaMKII/MEK1/ERK轴，增强了肺泡上皮细胞的钙流入和增殖[8]。这些发现建立了宏观机械矫正与肺发育背后的微观细胞和分子反应之间的联系。然而，MS调节肺免疫微环境（特别是巨噬细胞功能和极化）的机制仍不清楚。

巨噬细胞表现出显著的可塑性，并能根据微环境信号极化为不同的功能亚型，如促炎性的M1表型和抗炎/修复性的M2表型。它们在维持肺泡稳态以及调节炎症和组织修复中起着重要作用[9]、[10]、[11]。先前的研究已经证实，适度的MS在多种病理条件下都能有效促进巨噬细胞向M2表型的极化，包括动脉粥样硬化、骨关节炎、正畸牙齿移动、伤口愈合、骨质疏松症和骨骼发育不良[12]、[13]、[14]。例如，刘等人[15]证明，MS通过增加M2极化巨噬细胞的比例，促进了骨缺损区域的细胞增殖和血管生成-骨形成耦合，从而增强了骨骼再生。Beyersdorf等人[16]发现，MS通过调节Piezo1和TREK-1的活性，促进了M2极化巨噬细胞的维持，从而减少了破骨细胞介导的骨吸收并缓解了骨质疏松症。然而，在EOS + TIS相关的肺发育不良的病理背景下，MS如何以及通过何种机制调节巨噬细胞极化仍不清楚。重要的是，巨噬细胞的功能极化与细胞代谢状态紧密相关，这一过程被称为代谢重编程。传统观点认为，促炎性的M1极化巨噬细胞主要依赖糖酵解来快速产生能量，而促修复性的M2极化巨噬细胞则更倾向于依赖氧化磷酸化[17]、[18]。NGFS产生的有益MS是否能够驱动巨噬细胞的代谢重编程，从而促进其向促修复性M2表型的转变并增强其促血管生成能力？

为了验证这一假设，本研究使用小鼠RAW264.7巨噬细胞作为体外模型，并使用FX-5000 T系统施加不同幅度的MS。我们系统地评估了MS对RAW264.7细胞中M1/M2极化标志物、糖酵解酶、氧气消耗率（OCR）、细胞外酸化率（ECAR）和代谢谱的影响，并评估了MS处理的RAW264.7细胞条件培养基对人类脐静脉内皮细胞（HUVECs）血管生成的影响。此外，通过二次转录组分析确定了潜在的MS响应靶点。这些方法旨在扩展对EOS + TIS治疗的机制理解，将其与机械信号、免疫细胞功能和代谢调节的综合网络联系起来，同时提供关于NGFS治疗效果的更深入的免疫学和代谢学见解。

章节片段

RAW264.7细胞培养和MS处理

RAW264.7（#KCB 200603YJ；RRID: CVCL_0493）和HUVEC（#KCB 2010233YJ；RRID: CVCL_2959）来自中国科学院昆明细胞库，并在各自的专用培养基（#CM-0190；#CM-0122；Procell，中国）中培养。我们按照之前的描述[8]对RAW264.7细胞施加了梯度幅度的MS。MS是通过FX-5000 T张力系统（Flexcell International，美国）施加的，该系统是一种可以对细胞施加双轴应力的真空驱动设备。

MS改善了RAW264.7细胞的极化

本研究系统地探讨了梯度幅度MS对RAW264.7巨噬细胞极化表型的影响。流式细胞术显示，10%和15%幅度的MS将M1极化RAW264.7细胞中CD11b⁺CD86⁺细胞的比例分别从（38.66 ± 4.35）%降低到（28.66 ± 1.35）%和（20.14 ± 4.12）%。相比之下，5%的幅度没有显著影响（图1A）。与这些表型变化一致，RT-qPCR显示MS具有剂量依赖性

讨论

巨噬细胞极化在肺组织修复和纤维化进展中起着决定性作用，但在EOS + TIS背景下，机械信号调节这一过程的精确机制仍不明确。本研究表明，10%幅度的MS通过激活ITGAD/SOCS3/STAT3通路抑制了RAW264.7细胞中的糖酵解代谢重编程，从而促进了M2极化并增强了旁分泌促血管生成活性。这一发现将宏观

伦理、参与同意和发表同意声明

不适用。

CRediT作者贡献声明

张颖：撰写——原始草稿、可视化、验证、监督、资源、项目管理、方法学、研究、资金获取、正式分析、数据管理、概念化。李全：撰写——审阅与编辑、可视化、验证、方法学、研究、正式分析、概念化。徐世新：撰写——审阅与编辑、可视化、验证、方法学、研究、正式分析、概念化。罗阳：撰写——审阅与

资助

本研究得到了国家自然科学基金（82060414）和“云南振兴人才支持计划‘著名医生’专项基金（张颖，2022-XDYC-MY-2022-0026）的支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。