uORF及主ORF序列对果蝇疾病模型中Xrp1表达的调控及其功能研究

《PLOS Genetics》：The regulation of Xrp1 expression by uORFs and main ORF sequences and its function in Drosophila disease models

　　

综合应激反应(Integrated Stress Response, ISR)介导细胞对内质网(endoplasmic reticulum, ER)应激、氨基酸剥夺及线粒体功能障碍的适应性反应。ISR部分通过优先翻译转录因子ATF4调控基因表达，该过程受其5′前导序列中上游开放阅读框(upstream open reading frames, uORFs)的调节。在果蝇(Drosophila)中，Xrp1是ISR期间被诱导的另一转录因子，但其精确潜在机制尚不清楚。本研究报道，响应ER应激的Xrp1诱导受其uORFs及主ORF(main ORF)序列共同调控。Xrp1有7种剪接异构体，眼成虫盘(eye imaginal discs)中表达的两个主要转录本含uORFs。在该组织表达引起ER应激的ninaEG69D转基因可诱导Xrp1表达，但不显著改变Xrp1剪接异构体组成。含uORF的5′前导序列(尤其是第二个uORF的AUG密码子)置于报告基因上游时抑制DsRed表达。与ATF4不同，仅含uORF的5′前导序列不足以介导主ORF诱导；当同时存在Xrp1的5′前导序列和主ORF序列时，ninaEG69D表达盘中发生Xrp1诱导。功能上，Xrp1是持续光照下维持果蝇光受体完整性的必要条件。在不同疾病模型中，parkin突变体在特定组织中激活Xrp1靶基因表达，且Xrp1缺失增强parkin突变体在羽化(adult eclosion)期间的存活率。这些结果从分子和病理层面揭示了Xrp1在疾病模型中的调控机制与功能。

论文解读：《The regulation of Xrp1 expression by uORFs and main ORF sequences and its function in Drosophila disease models》（发表于《PLOS Genetics》）

一、研究背景与立题依据

真核细胞进化出多种应激反应通路以适应生理或环境压力，综合应激反应(Integrated Stress Response, ISR)即其中之一。ISR由应激活化的eIF2α激酶启动，被磷酸化的eIF2α抑制eIF2B活性，降低eIF2–GTP–Met?tRNA_i三元复合物(triple complex, TC)的可及性，从而选择性促进含上游开放阅读框(upstream open reading frames, uORFs)的mRNA——如酵母GCN4和后生动物ATF4——的主ORF翻译。ATF4的诱导机制已较为明确：其5′UTR中的uORFs在正常条件下抑制主ORF翻译，而eIF2α磷酸化导致扫描核糖体重新获取TC延迟，使其跳过某些uORF起始密码子，转而翻译下游主ORF。

在黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中，bZIP家族转录因子Xrp1(e(Xrp1)-like protein 1)也被证实参与ISR。既往研究表明，在核糖体蛋白(ribosomal protein, Rp)基因单倍不足导致的Minute突变体细胞竞争(cell competition)模型中，Xrp1经RpS12介导的可变剪接产生短异构体促细胞凋亡，且该过程中Xrp1位于eIF2α磷酸化上游。然而，在ER应激模型中（如眼成虫盘表达ninaE^G69D突变视紫红质），Xrp1诱导发生于eIF2α磷酸化(PERK依赖)下游，提示不同应激背景下Xrp1可能有不同调控模式。虽有推测Xrp1也受其5′前导区uORFs调控，但是否仅依赖uORFs、是否涉及主ORF序列、ER应激下剪接异构体是否变化、以及Xrp1在经典疾病模型中的功能均不明确。为此，研究人员开展本研究以阐明Xrp1在ER应激下的分子调控机制并评估其在视网膜色素变性及帕金森病果蝇模型中的生理功能。

二、主要关键技术方法

研究人员利用已发表的果蝇眼成虫盘RNA?seq数据（对照GMR>EGFP?KASH与ER应激GMR>ninaE^G69D+ EGFP?KASH，n＝3生物学重复），采用VAST?TOOLS分析Xrp1可变剪接并计算Percent Spliced In(PSI)/Percent Spliced Out(PSO)；构建含不同Xrp1异构体5′前导序列驱动DsRed的UAS报告转基因及全长Xrp1 F异构体C端融合3xHA的UAS报告转基因（含uORF2起始密码子ATG→CCG突变体），通过Actin?Gal4或GMR?Gal4驱动，利用荧光显微镜及共聚焦显微镜定量DsRed/HA信号；以GMR>ninaE^G69D诱导ER应激，以Xrp1^M2?73缺失突变体及parkin^Δ21/parkin²⁵突变体为遗传材料，使用gstD?GFP为Xrp1靶基因报告系统；通过深伪瞳(deep pseudopupil, Dpp)检查及视网膜半薄切片观察光照/黑暗条件下Xrp1突变体视网膜退化；统计parkin单突与parkin; Xrp1双突羽化成虫死亡率(Wilcoxon秩和检验)。

三、研究结果

Xrp1 transcript composition does not change significantly in response to ER stress caused by ninaE^G69Dexpression in eye discs（眼成虫盘ninaE^G69D诱导ER应激后Xrp1转录本组成无显著改变）

Xrp1基因座有7种mRNA剪接异构体：RA/RB/RF/RG编码长异构体(Xrp1^long，含exon 4)，RC/RD/RE编码短异构体(Xrp1^short，缺exon 4)。通过对对照与ninaE^G69D表达眼成虫盘的RNA?seq Sashimi图及PSI/PSO定量分析，研究人员发现含exon 4的异构体约占85%，且ER应激不改变异构体比例(PSI无显著差异，p＞0.05)。表明ER应激下Xrp1调控不依赖转录水平变化或可变剪接切换，而可能是翻译或翻译后水平调控。

The reporter experiments show that Xrp1 F and G isoforms contain inhibitory 5′ leaders（报告实验显示Xrp1 F和G异构体含抑制性5′前导序列）

将Xrp1各异构体(RC/RD无uORF；RF含2个uORF，其中uORF2与主ORF重叠不同读码框；RG含1个uORF且与主ORF重叠)的5′前导序列分别置于DsRed上游，Actin?Gal4驱动下，含uORF的F/G异构体来源报告基因DsRed荧光显著低于无uORF的C/D异构体来源报告基因(p＜0.01)。证明Xrp1含uORF的5′前导序列可在基础条件下抑制主ORF表达。

The expression of HA reporters indicates that the uORF2 of Xrp1's F isoform inhibits the main ORF translation（HA报告基因表达表明Xrp1 F异构体uORF2抑制主ORF翻译）

构建Xrp1 F异构体5′前导＋全长Xrp1^long?3xHA报告载体，野生型在基础条件下HA信号极弱；而将uORF2起始ATG突变为CCG后，HA信号显著增强(p＜0.05)。说明正常条件下核糖体沿5′前导扫描先翻译uORF2从而减少主ORF翻译，uORF2 AUG是主要抑制位点。

Xrp1 induction by ninaE^G69Dexpression in eye discs is regulated by both the 5′UTR and Xrp1's main coding sequence（眼成虫盘ninaE^G69D诱导Xrp1需5′UTR和Xrp1主编码序列共同参与）

将果蝇ATF4(crc) 5′前导连DsRed的报告基因在GMR>ninaE^G69D盘中明显诱导；但仅换用Xrp1 F 5′前导(无Xrp1主ORF)的DsRed报告在基础及ER应激下均无诱导。相反，含Xrp1 F 5′前导＋全长主ORF?3xHA的报告在ninaE^G69D诱导的ER应激下HA信号较基础条件显著升高(p＜0.05)，uORF2突变体则基础与应激下均高表达。表明不同于ATF4仅靠5′前导uORFs介导应激诱导，Xrp1在果蝇眼成虫盘ER应激下的诱导需5′前导uORFs与主ORF编码序列共同作用。

The pseudopupil analysis and semithin sections show that Xrp1 is required to prevent light-induced retinal degeneration（伪瞳分析与半薄切片显示Xrp1是防止光诱导视网膜变性所必需的）

Xrp1^M2?73缺失突变体在持续白光(240–258 Lux)下饲养，羽化后约20天深伪瞳(Dpp)消失率显著高于野生型对照(w¹¹¹⁸)(p值经Log?rank检验)，而暗饲养下无差异；第20天视网膜半薄切片显示突变体小眼(ommatidia)及感杆(rhabdomere)结构紊乱，对照组完好。证明Xrp1对持续光照应激下果蝇光受体稳态维持具保护作用。

The reporter experiments suggest that parkin regulates Xrp1 expression and Xrp1 loss reduces the lethality of parkin mutants after eclosion（报告实验提示parkin调控Xrp1表达且Xrp1缺失降低parkin突变体羽化后致死率）

parkin^Δ21/parkin²⁵突变体成虫腹部及三龄幼虫脂肪体中Xrp1靶报告基因gstD?GFP显著诱导，该诱导在parkin; Xrp1双突中消失，确认parkin缺失激活Xrp1介导的转录。parkin单突羽化当日死亡率近50%，而parkin; Xrp1双突死亡率显著降低(p经Wilcoxon秩和检验)。说明Xrp1在parkin线粒体应激模型中起有害作用，其缺失可改善parkin突变体羽化存活。

四、讨论与结论总结（翻译并浓缩讨论中研究结论部分）

Xrp1因参与细胞竞争及退行性疾病模型受到关注。本研究在ER应激模型中揭示不同于Minute细胞竞争模型（后者靠RpS12依赖可变剪接产生无uORF异构体激活Xrp1，且Xrp1位于eIF2α磷酸化上游）的调控模式：眼成虫盘ER应激下Xrp1剪接异构体组成不变，含uORF的异构体仍为主，uORF2在正常条件下抑制主ORF翻译，ER应激(eIF2α?PERK通路)下Xrp1诱导需5′前导uORFs及主ORF序列共存——与仅依赖5′前导uORFs的经典ATF4/GCN4机制不同，提示主ORF可能影响mRNA二级结构或存在未明顺式元件参与精细调控。功能上，Xrp1是持续光照下光受体存活的保护因子，但在parkin线粒体缺陷模型中促进羽化致死，体现环境/疾病背景依赖的双重角色。综上，本研究阐明Xrp1依应激类型受不同机制调控，并明确其在果蝇退行性疾病模型中的生理相关性，为理解ISR非典型转录因子的翻译调控提供新视角。