《Current Plant Biology》：Screening and functional research of methyltransferase genes involved in the biosynthesis of BIAs in Liriodendron tulipifera L.
编辑推荐：
摘要：鹅掌楸（Liriodendron tulipifera）是结构多样的阿朴啡型苄基异喹啉生物碱（BIAs）的丰富来源，其具有抗氧化、抗肿瘤及抗风湿等多种药理活性，显示出显著的药用潜力。然而，由于植物体内天然含量低以及合成生物学产量不高，这些化合物的临床开发
摘要：鹅掌楸（Liriodendron tulipifera）是结构多样的阿朴啡型苄基异喹啉生物碱（BIAs）的丰富来源，其具有抗氧化、抗肿瘤及抗风湿等多种药理活性，显示出显著的药用潜力。然而，由于植物体内天然含量低以及合成生物学产量不高，这些化合物的临床开发受限，其中酶资源与催化效率是后者的核心限制因素。甲基转移酶（MTs）对决定阿朴啡生物碱的多样性与生物活性至关重要，但在鹅掌楸中仍鲜有表征。研究人员整合基因组与进化分析，揭示鹅掌楸经历了一起全基因组复制（WGD）事件，其扩张的基因家族显著富集于次生代谢通路。对关键BIA通路基因的系统发育分析显示，木兰类（Magnoliids）与毛茛目（Ranunculales）共享共同祖先，而在无患子目（Sapindales）中独立演化。基于基因组数据，共鉴定出65个甲基转移酶基因（含58个O-甲基转移酶（OMTs）和7个N-甲基转移酶（NMTs））。通过系统发育与表达模式分析，筛选出8个OMT和2个NMT候选基因。酶活实验表明，LtOMT37和LtOMT44催化C7 O-甲基化，而LtNMT4和LtNMT6催化多种BIA通路底物的N-甲基化。本研究首次报道了鹅掌楸属中7-O-甲基转移酶的表征，为解析木兰类中阿朴啡BIA通路奠定基础，并为BIAs的可持续生产提供新遗传资源。
论文解读：《Screening and functional research of methyltransferase genes involved in the biosynthesis of BIAs in Liriodendron tulipifera L.》
一、研究背景与意义
苄基异喹啉生物碱（BIAs）是一类具有重要临床价值的植物次生代谢产物，其中阿朴啡型BIAs具备抗疟、抗菌及抗癌等显著药理活性。由于化学结构复杂，BIAs的化学合成面临路线冗长、产率低、成本高及非环境友好等挑战，目前临床相关药物仍高度依赖植物提取。然而，植物内源含量低及合成生物学中酶资源与催化效率不足，限制了其商业化与临床应用。
生物合成途径的解析是实现BIAs可持续生产的核心。目前，在毛茛目（如黄连）、睡莲目（莲）及无患子目（黄檗）等代表物种中，BIAs核心途径已逐步阐明，关键酶如(S)-去甲劳丹碱合酶（NCS）、细胞色素P450氧化还原酶（CYP450）及O/N-甲基转移酶（O-/N-MTs）已被克隆与验证。其中，甲基转移酶（MTs）通过催化O-与N-甲基化反应，显著提升BIAs的化学多样性、分子稳定性及生物活性，是结构分化的关键驱动力。
木兰类（Magnoliids）植物如鹅掌楸（Liriodendron tulipifera）主要积累阿朴啡型BIAs，但其生物合成途径尤其是甲基化步骤仍大多未明。本研究以鹅掌楸为对象，结合比较基因组学、进化分析与生化验证，筛选并表征参与BIAs生物合成的甲基转移酶基因，旨在揭示木兰类阿朴啡生物碱的演化与代谢机制，为合成生物学提供新酶学资源。该研究成果发表于《Current Plant Biology》。
二、主要关键技术方法概览
研究人员以鹅掌楸及12个代表性植物物种的基因组数据为基础，利用OrthoFinder鉴定直系同源基因，基于单拷贝直系同源基因使用RaxML构建最大似然系统发育树，并以r8s估算分化时间，CAFé分析基因家族扩张收缩。通过WGD软件计算同义替换率（Ks），结合MCScanX与JCVI进行基因组内/间共线性分析以推断全基因组复制（WGD）事件。转录组数据来自NCBI SRA（Liriodendron chinense根、叶、皮），使用HISAT2比对至鹅掌楸参考基因组以分析表达量（FPKM）。以已知BIAs途径酶序列为查询进行BLASTP筛选候选O/NMT、CYP450及NCS基因，经IQ-TREE构建系统发育树并结合组织表达模式筛选靶基因。候选基因经大肠杆菌BL21(DE3)异源表达与镍亲和层析纯化，以多种BIAs为底物进行体外酶活反应，产物通过HPLC与UPLC-MS/MS进行定性分析。
三、研究结果
3.1 物种进化关系与基因家族演化
基于182个单拷贝基因家族的进化重建显示，鹅掌楸与近缘种凸头木兰（Magnolia biondii）形成姐妹群，分化时间约66.25百万年前（MYA）；与同属鹅掌楸（L. chinense）分化于约27.04 MYA。与番荔枝科、樟科、马兜铃科及水稻、葡萄的分化时间依次递增，最早与基部被子植物无油樟（Amborella trichopoda）分化于约191.71 MYA。
比较基因组学鉴定出12,411个扩张基因家族，其中1,021个快速扩张家族显著富集于代谢与次生代谢通路（如KEGG富集），暗示其与BIAs生物合成及环境适应相关。
3.1.1 全基因组复制事件与共线性分析
基因组内共线性与Ks分布共同指示鹅掌楸经历一次WGD事件。旁系同源基因对的Ks峰约在0.72，对应约86.65 MYA；近缘种番荔枝（Annona cherimolia）Ks峰（~0.15）更低，WGD更晚。种间Ks比较显示，鹅掌楸与葡萄的Ks超0.72（分化早于WGD），而与马兜铃及凸头木兰的Ks低于0.72（分化晚于WGD）。基因组内呈现典型1:2同源块（如Chr1-Chr15、Chr2-Chr4），鹅掌楸与凸头木兰的种间共线性高度保守。WGD衍生基因同样显著富集于次生代谢通路，提示WGD可能增强了BIAs等次生产物的合成潜力。
3.1.2 BIA生物合成关键酶NCS、O/NMT及CYP450的系统发育关系
选取木兰目、樟目、胡椒目、毛茛目及无患子目代表种，分析关键酶同源基因。
NCS系统发育显示，木兰类、毛茛目及无患子目的NCS同源物与PR10（病原相关蛋白10）共起源。已表征的催化NCS多属Ⅰ亚支，Ⅱ亚支多为非催化同源物；但马兜铃（Aristolochia contorta）的LcNCS保留缩合活性，研究人员建议合并两亚支为一支，部分成员可能发生功能丧失。
O-甲基转移酶（OMTs）系统发育显示，木兰类与毛茛目同源物聚为一支，而无患子目黄檗（Phellodendron amurense）的功能OMT形成独立分支，表明前者共享祖先，后者独立演化。BIA OMTs按催化位点分：6OMT（C6 O-甲基化）、4'OMT（C4' O-甲基化）、2OMT、7OMT、SOMT（紫堇斯卡灵9-O-甲基化）及具N-甲基化活性的NOMT。
N-甲基转移酶（NMTs）按底物分：CNMT（可待因-N-甲基转移酶，作用于可卡林）、TNMT（四氢原小檗碱顺式-N-甲基转移酶）、RNMT（网状结构-N-甲基转移酶）。木兰类中NMT同源物主要位于CNMT支，仅一个LtNMT聚入TNMT，无RNMT代表，这与木兰类主要积累阿朴啡型BIAs及缺乏其他类型BIAs相吻合。
CYP450分析显示，木兰类同源物聚入CYP80与CYP719亚家族，无患子目黄檗无对应聚类；CYP82（参与原小檗碱等合成）仅见于毛茛目黄连，木兰类与黄檗均缺如，解释了木兰类不积累对应生物碱的原因。
3.1.3 鹅掌楸BIA途径相关O/NMT基因鉴定与筛选
将鹅掌楸O/NMT同源物与已表征酶建树并结合表达谱筛选。OMT中，6OMT、4'OMT、2OMT、7OMT各含一个聚类基因（LtOMT13、LtOMT14、LtOMT43、LtOMT44），6个基因（LtOMT15-18、LtOMT41-42）聚入SOMT支。黄檗BIAs基因独立成簇。表达热图显示9个基因在叶高表达，7个在根，6个在茎；其余低或沉默。最终结合进化与表达选8个OMT（LtOMT3、LtOMT7、LtOMT25、LtOMT37、LtOMT39、LtOMT44、LtOMT49、LtOMT51）。
NMT中，6个聚入CNMT（LtNMT4、LtNMT6等），1个（LtNMT2）入TNMT，无RNMT。LtNMT4与LtNMT6表达较高，LtNMT2几乎沉默。最终选LtNMT4与LtNMT6为候选。
3.1.4 鹅掌楸OMT基因功能验证
将候选OMT在 Escherichia coli BL21(DE3)中异源表达并纯化（~35-40 kDa），以(S)-可卡林、(S)-N-甲基可卡林、(S)-网状结构为作用物，热失活蛋白为对照，HPLC与UPLC-MS/MS检测。
以(S)-可卡林为底物，LtOMT37与LtOMT44在11.1 min产生新峰，对照无；产物保留时间与标准一致，MS/MS碎片m/z 107、143、194、209匹配，鉴定为去甲阿美巴文（norarmepavine），表明催化C7 O-甲基化。
以(S)-N-甲基可卡林为底物，两者在10.7 min出新峰，MS/MS碎片m/z 107、143、197匹配阿美巴文（armepavine）。
以(S)-网状结构为底物，两者在11.4 min出新峰，碎片m/z 107、115、219与底物匹配，推测为C7 O-甲基化产物。其余6个OMT候选对上述底物未检出新峰。
3.1.5 鹅掌楸NMT基因功能验证
以(S)-N-甲基可卡林、阿美巴文、(S)-网状结构为底物。
LtNMT4与LtNMT6以(S)-N-甲基可卡林为底物在9.7 min出新峰，MS/MS m/z 107、143、195匹配木兰花碱（magnocurarine）。
以(S)-网状结构为底物在10.1 min出新峰，共有m/z 107、115，暂定为tembetarine（网状结构N-甲基化产物）。
以阿美巴文为底物在9.9 min出新峰，MS/MS m/z 107、143、194匹配7-O-甲基木兰花碱（7-O-methylmagnocurarine）。
热失活对照均无新峰。
四、总结与结论翻译
鹅掌楸是重要的药用与观赏树种，积累多样BIAs。本研究整合比较基因组学、进化分析、转录组与生化实验，探究鹅掌楸BIAs生物合成相关的甲基转移酶基因。鉴定出一次谱系特异性全基因组复制（WGD）事件及甲基转移酶相关基因家族的显著扩张，为特化生物碱代谢提供了进化基础。通过系统发育与表达分析筛选出候选O-甲基转移酶与N-甲基转移酶基因。功能表征进一步显示，LtOMT37、LtOMT44、LtNMT4与LtNMT6可催化多种BIA中间体的甲基化反应，为阿朴啡型生物碱生物合成中此前未表征的步骤提供了证据。该多层次数据集为基因挖掘提供了宝贵资源，并为理解木兰类中BIAs生物合成的分子与进化基础提供了新视角。
