《Frontiers in Plant Science》：High aspect ratio graphene oxide: a highly efficient plasmid DNA deliverer for plant seed
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引言：植物基因工程在作物改良和天然产物生物合成中发挥核心作用。然而，植物细胞壁作为天然屏障，限制外源生物分子的有效递送，尤其是质粒DNA进入植物细胞内部。方法：研究人员在此介绍一种新型氧化石墨烯（graphene oxide, GO），其特征为高纵横比，通过在
引言：植物基因工程在作物改良和天然产物生物合成中发挥核心作用。然而，植物细胞壁作为天然屏障，限制外源生物分子的有效递送，尤其是质粒DNA进入植物细胞内部。方法：研究人员在此介绍一种新型氧化石墨烯（graphene oxide, GO），其特征为高纵横比，通过在0.5 mol/L NaOH水溶液中进行低电压、低电流、长时间电化学氧化合成。为评估高纵横比氧化石墨烯（high aspect ratio graphene oxide, HARGO）递送外源基因的效率，将Poa crymophila Keng种子浸泡并萌发于含有HARGO和质粒DNA pEG100-PcNAC2-EGFP的溶液中。结果：HARGO表现出有利特性，包括小横向尺寸和单原子层厚度（0.414 nm），可直接穿透植物组织甚至细胞壁。值得注意的是，HARGO可物理吸附质粒DNA并促进其进入植物细胞进行基因递送，无需聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）或聚乙烯亚胺（polyethyleneimine, PEI）等化学修饰。在萌发幼苗中成功观察到对应EGFP的荧光信号，阳性转化率达90%。讨论：这些发现为植物基因工程提供了一种新型无需组织培养的质粒DNA递送工具，将显著推进植物生物技术的发展。
**研究背景与问题**
植物基因工程在作物改良、天然产物生物合成及生物制药领域具有关键作用，但植物细胞壁构成天然屏障，限制了外源生物分子（尤其是质粒DNA）的有效递送。现有遗传转化工具均存在局限：农杆菌介导法受宿主范围（偏好双子叶）、组织特异性和基因型依赖限制；基因枪法存在组织损伤、高成本及多拷贝插入导致基因沉默等问题；病毒载体法因病原性及基因组整合风险面临严格监管。因此，亟需开发高效、安全、适用性广的新型DNA递送方法。纳米材料在动物细胞基因递送中已有大量研究，但在植物系统中的应用仍不充分。部分纳米材料（如介孔二氧化硅纳米颗粒MSNs、碳纳米管CNTs等）虽能穿透细胞壁，但通常需要化学修饰或机械辅助，且组织深层穿透能力有限。氧化石墨烯（graphene oxide, GO）具有比表面积大、亲水性强、低毒性等优点，但传统GO递送质粒DNA需经PEG和PEI化学修饰，导致复合物体积增大，仅能递送至组织表层。为此，研究人员开发了一种新型高纵横比氧化石墨烯（HARGO），期望实现无需化学修饰的高效质粒DNA递送。
**研究内容与结论**
研究人员通过低电压、低电流、长时间电化学氧化法成功合成HARGO，并利用荧光特性、原子力显微镜（AFM）、紫外可见光谱（UV-Vis）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和Zeta电位等手段系统表征其理化性质。将小麦种子浸泡于HARGO溶液后，通过冷冻切片和激光共聚焦显微镜观察到HARGO能穿透小麦种子的腹沟、胚乳、胚芽及根部的细胞壁并进入细胞内。进一步将HARGO与质粒DNA pEG100-PcNAC2-EGFP（11,798 bp）混合，通过UV-Vis、PCR和AFM证实其物理吸附能力。以Poa crymophila Keng cv. Qinghai种子为模型，将种子播于含HARGO-质粒复合物的基质中，14天后通过激光共聚焦检测到绿色荧光蛋白（GFP）信号，PCR扩增出978 bp特异条带，随机检测10株幼苗中9株呈阳性，转化率达90%。该论文发表在《Frontiers in Plant Science》。
**关键技术与方法**
1. **电化学氧化合成HARGO**：以石墨棒为阳极、铂电极为阴极，在0.5 mol/L NaOH水溶液中，于3.5 V电压、0.03 A电流下电解96小时，经透析和干燥获得HARGO。
2. **表征技术**：采用原子力显微镜（AFM）测定厚度和形貌；紫外可见光谱（UV-Vis）和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析官能团；Zeta电位和滴定测试评估表面电荷及羧基含量。
3. **组织穿透与递送验证**：利用HARGO自身荧光，通过倒置荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察其在植物种子（小麦ZKM138）及幼苗根部的分布；对Poa crymophila Keng cv. Qinghai种子进行HARGO-质粒复合物浸泡处理，通过激光共聚焦检测EGFP荧光，并通过PCR扩增确认质粒DNA存在。
（样本来源：小麦品种中科麦138（ZKM138）和Poa crymophila Keng cv. Qinghai种子均由中国科学院成都生物研究所提供。）
**研究结果**
**Preparation and characterization of HARGO（HARGO的制备与表征）**
通过AFM测得HARGO片层厚度0.414 nm，形貌呈长条形，长宽比约8:1，纵向有裂缝。UV-Vis显示在192 nm处有强吸收峰，225、260、295 nm处有肩峰；FT-IR证实存在羧基（COO
-）和羟基（-OH），无自由羰基。Zeta电位（pH=7）为-8.5 mV，表面羧基pKa约4.82，浓度约7.8×10
-3 mol/g，单位质量表面电荷约-751 C/g。HARGO水溶液在紫外光下发荧光，最大激发波长492 nm，最大发射波长510 nm。
**HARGO can significantly penetrate various tissues and cells in wheat seeds（HARGO可显著穿透小麦种子多种组织和细胞）**
将小麦种子浸泡于HARGO水溶液后冷冻切片，倒置荧光显微镜观察到HARGO分布于胚、胚乳、腹沟等部位；激光共聚焦显示在胚形成层和根部细胞壁及胞内均大量存在，证明HARGO可穿透细胞壁进入细胞内部。HARGO对小麦种子无明显细胞毒性，且促进幼苗和根系生长。
**Adsorption capacity of HARGO for plasmid DNA pEG100-PcNAC2-EGFP（HARGO对质粒DNA pEG100-PcNAC2-EGFP的吸附能力）**
UV-Vis分析显示HARGO与质粒DNA混合后，225 nm处吸收值低于两者单独相加的预期值，且吸收峰红移；以混合液为模板的PCR未扩增出目标条带，表明HARGO物理吸附质粒DNA阻碍引物结合；AFM直接观察到HARGO表面结合有质粒DNA。
**HARGO-mediated delivery of pEG100-PcNAC2-EGFP plasmid DNA to Poa crymophila Keng（HARGO介导pEG100-PcNAC2-EGFP质粒DNA递送至Poa crymophila Keng）**
将种子播于含HARGO-质粒复合物的干燥基质中，14天后激光共聚焦检测到叶尖部位有GFP荧光信号，而水、HARGO单独、质粒单独组均无荧光；PCR在HARGO+质粒组幼苗中扩增出978 bp特异条带；随机检测10株幼苗中9株呈阳性，转化率90%。研究还对比传统GO经PEG/PEI修饰后复合物体积大、仅能递送至表层，而HARGO因体积小、形态细长可直接携带质粒DNA进入组织深层。
**总结讨论与结论翻译**
讨论部分指出HARGO用于种子介导DNA递送仍存在限制：制备周期长（需严格低电压低电流）、材料用量大、质粒DNA消耗高、转化效率未达100%。优化策略包括探索简化合成路线、对HARGO进行表面功能改性以降低使用浓度、引入吸收促进剂并缩小处理体积、阐明HARGO-质粒复合物与植物细胞的相互作用机制并优化浸泡时间和温度等。选择PcNAC2基因质粒作为模型载体，因其已证实可稳定转化植物细胞且表达高效，便于评估递送效率并为进一步功能研究奠定基础。此外，讨论还综述了GO在抗菌、药物递送、环境治理、能量存储、以及基因递送（如肿瘤治疗、骨科修复等）领域的最新进展。
**结论部分翻译**：本研究成功利用低电压、低电流、长时间电化学氧化方法开发了一种新型氧化石墨烯，称为HARGO。HARGO显示出显著的植物组织穿透能力，能高效吸附并将质粒DNA递送至Poa crymophila Keng种子，产生转基因植株，转化效率高达90%。与传统的质粒DNA递送方法（如农杆菌介导、基因枪、电穿孔和植物病毒递送方法）相比，HARGO作为递送载体具有速度快、操作简单、安全性高、转化效率高和成本低的独特优势。凭借其独特性质，HARGO有望在植物转基因、基因编辑和基因敲除等领域发挥关键作用，从而促进作物改良和农业生产。此外，考虑到HARGO穿透组织细胞的能力，它在医学领域也具有重要潜力，可用于肿瘤靶向治疗、遗传病治疗和基因治疗。最终，HARGO的高纵横比和穿透能力为其作为纳米药物载体提供了新的机遇，尤其是在提高药物递送效率和靶向精度方面。总之，本研究成功合成了高纵横比GO，并展示了其在不涉及组织培养的植物遗传转化中的应用潜力。作为一种新型纳米载体，HARGO在生物技术和医学领域具有重要的未来应用前景，值得进一步研究和开发。
