《Frontiers in Behavioral Neuroscience》：Functional loss of PKMζ in the dorsal hippocampus potentiates the time-dependent increase in false contextual fear memory and impairs spatial recognition memory in mice
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**摘要**
**引言**：虚假情境恐惧记忆归因于情境记忆表征的时间依赖性精度丧失。本研究探讨了蛋白激酶Mζ（PKMζ）——海马依赖性长时记忆维持的关键分子——在背侧海马（dHPC）和腹侧海马（vHPC）中虚假情境恐惧记忆中的作用。
**方法**：行为
**摘要**
**引言**：虚假情境恐惧记忆归因于情境记忆表征的时间依赖性精度丧失。本研究探讨了蛋白激酶Mζ（PKMζ）——海马依赖性长时记忆维持的关键分子——在背侧海马（dHPC）和腹侧海马（vHPC）中虚假情境恐惧记忆中的作用。
**方法**：行为测试前两周，研究人员向雄性C57BL/6J小鼠（7–10周龄）的dHPC或vHPC双侧注射腺相关病毒（AAV PHP.eB），以诱导PKMζ敲低（PKMζ KD）、野生型PKMζ过表达（PKMζ WT）或激酶失活PKMζ过表达（PKMζ K281R）。通过在有或无无条件刺激呈现[分别记为US(+)和US(?)]的情况下，在暴露于情境A后3小时和24小时时测量情境B中的僵直行为来评估虚假情境恐惧记忆。使用Y迷宫中的双试次新臂识别测试评估空间识别记忆。
**结果**：如先前工作所示，在情境A中接受US后，小鼠在情境B中表现出僵直，而未接受该刺激的小鼠僵直极少。这些数据证实情境B中的僵直反映了虚假情境恐惧记忆。虚假恐惧反应在3小时时已明显，并在24小时时进一步增加。与注射AAV对照的小鼠相比，dHPC PKMζ敲低小鼠在24小时时的僵直显著增强。PKMζ WT过表达阻止了24小时时僵直的增加，而PKMζ K281R过表达模拟了PKMζ KD的效果。此外，dHPC中PKMζ敲低损害了空间识别记忆，表明海马依赖性空间处理受到破坏。相比之下，vHPC中PKMζ操作不影响虚假情境恐惧记忆，但确实损害了空间识别记忆。
**讨论**：这些发现与以下可能性一致：dHPC中PKMζ的功能丧失以可能促进虚假情境恐惧的时间依赖性增加并损害空间识别记忆的方式影响情境记忆过程。
### 论文解读：背侧海马PKMζ功能丧失对虚假情境恐惧记忆及空间识别记忆的影响
#### 研究背景与问题
恐惧泛化（fear generalization）是个体对新异或模糊环境中的潜在威胁做出反应的适应过程，但过度泛化会发展为适应不良，成为创伤后应激障碍（post-traumatic stress disorder, PTSD）等焦虑障碍的核心特征。PTSD患者常对部分相似于创伤背景的线索表现出增强的恐惧反应，这被认为反映了情境辨别能力的下降。在啮齿动物中，情境特异性的下降被操作化为虚假情境恐惧记忆（false contextual fear memory），即动物在与条件化环境相似但不相同的背景中表现出僵直行为。尽管啮齿动物模型不能完全再现精神障碍，但为研究限制不当恐惧表达的神经机制提供了有价值的实验框架。
先前研究显示，虚假恐惧记忆可在条件化后3小时内出现，并在再次暴露于相似情境后进一步强化。研究人员此前的工作表明，早期暴露于相似情境对于虚假情境恐惧的逐步放大是必要的，而单纯的时间流逝不足以解释其增加。此外，应激相关的糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor, GR）激活结合盐皮质激素受体（mineralocorticoid receptor, MR）失活可促进虚假恐惧的时间依赖性增强，而GR信号可能通过调节突触可塑性相关蛋白（包括PKMζ）来介导这一效应。PKMζ是一种自主活性蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）亚型，在维持长时记忆和稳定突触增强中起关键作用。然而，PKMζ是否参与限制虚假情境恐惧记忆的形成和放大尚不清楚。因此，本研究旨在探究背侧海马（dorsal hippocampus, dHPC）和腹侧海马（ventral hippocampus, vHPC）中PKMζ对虚假情境恐惧记忆的调控作用。
#### 研究概述与结论
本研究使用成年雄性C57BL/6J小鼠，通过向dHPC或vHPC的CA2/CA3区域双侧注射腺相关病毒（AAV PHP.eB血清型），实现PKMζ的敲低（knockdown, KD）、野生型PKMζ过表达（PKMζ WT）或激酶失活突变体PKMζ K281R过表达。行为测试采用情境恐惧条件化范式，在条件化后3小时和24小时评估虚假情境恐惧记忆（即在不匹配电击的情境B中的僵直行为），并使用Y迷宫双试次新臂识别测试评估海马依赖性空间识别记忆。
主要结论如下：dHPC中PKMζ敲低增强了从3小时到24小时虚假恐惧反应的时间依赖性增加；PKMζ WT过表达则阻止了该增加；而PKMζ K281R过表达模拟了敲低的效应，进一步增强了虚假恐惧。相比之下，vHPC中PKMζ的敲低或过表达均不影响虚假情境恐惧记忆。此外，dHPC和vHPC中的PKMζ敲低均损害了空间识别记忆。这些结果表明，dHPC中PKMζ的激酶活性作为分子刹车，限制虚假情境恐惧记忆在记忆再激活后的早期放大，而vHPC中PKMζ对虚假恐惧无关，但其对空间记忆的贡献提示海马不同亚区在记忆加工中的功能分化。
本研究论文发表在《Frontiers in Behavioral Neuroscience》。
#### 关键技术方法
1. **病毒载体构建与递送**：使用AAV PHP.eB血清型（对CA2/CA3锥体神经元具有高嗜性）携带shRNA（靶向*Prkcz* mRNA）或PKMζ编码序列，通过立体定位注射分别靶向dHPC或vHPC的CA2/CA3区域（坐标依据Paxinos小鼠脑图谱）。病毒滴度经qPCR定量。
2. **行为学测试**：采用情境恐惧条件化范式（情境A为条件刺激CS，足底电击为无条件刺激US），在US(+)条件下于3h和24h检测情境B中的僵直百分比；并采用Y迷宫双试次新臂识别测试（间隔1小时）评估空间识别记忆，记录新臂进入潜伏期、时间百分比、路程百分比和进入次数。
3. **免疫组织化学验证**：使用抗RFP抗体和抗PKCζ/PKMζ抗体对脑切片进行荧光染色，共聚焦显微镜确认病毒注射位点和转导效率，并验证PKMζ表达变化。
#### 研究结果
**3.1 验证dHPC中PKMζ敲低及其对虚假情境恐惧记忆的影响**
通过免疫印迹和免疫组化证实AAV-Prkcz-shRNA显著降低了原代培养神经元和dHPC CA3锥体神经元中的PKMζ蛋白水平。在US(?)条件下，PKMζ KD小鼠与对照小鼠在情境A和情境B中的自发活动无差异，且条件化期间僵直水平无差异，表明PKMζ敲低不影响恐惧习得。在US(+)条件下，两组在3小时时均表现出明显的虚假恐惧（僵直显著高于US(?)组），但PKMζ KD小鼠在24小时时的僵直显著高于对照，且从3到24小时的僵直增幅也显著更大。结论：dHPC中PKMζ敲低促进了虚假情境恐惧记忆的时间依赖性增加。
**3.2 dHPC中PKMζ WT和K281R过表达对虚假情境恐惧记忆的影响**
免疫印迹和免疫组化证实AAV-PKMζ WT和AAV-PKMζ K281R均显著增加了PKMζ蛋白水平。在US(?)条件下，三组自发活动无差异；条件化期间僵直无差异。在US(+)条件下，三组在3小时时均表现出类似的虚假恐惧。但PKMζ WT过表达完全阻止了24小时时僵直的进一步增加（与3小时相比无显著差异），而PKMζ K281R过表达则使24小时僵直显著高于对照，且僵直增幅也显著大于对照。结论：dHPC中PKMζ激酶活性丧失模拟了敲低表型，而野生型PKMζ过表达抑制了虚假恐惧的放大。
**3.3 背侧海马PKMζ在海马依赖性空间记忆中的作用**
在Y迷宫新臂识别测试中，PKMζ KD小鼠与对照相比总路程无差异，但进入新臂的潜伏期显著延长。对照小鼠在新臂中花费的时间和路程显著多于熟悉臂，而PKMζ KD小鼠在新臂与熟悉臂之间无差异，且进入次数无差异。结论：dHPC中PKMζ功能丧失损害了海马依赖性空间识别记忆。
**3.4 vHPC中PKMζ敲低不影响虚假情境恐惧记忆**
免疫组化验证vHPC中PKMζ表达成功降低。在US(?)条件下，PKMζ KD小鼠与对照自发活动无差异；条件化期间僵直无差异。在US(+)条件下，两组在3小时和24小时时均表现出类似的虚假恐惧，且24小时僵直增加幅度无组间差异。结论：vHPC中PKMζ敲低不影响虚假情境恐惧记忆的形成或时间依赖性增强。
**3.5 vHPC中PKMζ WT和K281R过表达对虚假情境恐惧记忆的影响**
免疫组化证实vHPC中PKMζ成功过表达。各组在US(?)条件下自发活动无差异；条件化期间僵直无显著组效应。在US(+)条件下，三组在3小时时均表现出类似的虚假恐惧，24小时僵直水平及增幅均无组间差异。结论：vHPC中PKMζ WT或K281R过表达均不影响虚假情境恐惧记忆。
**3.6 腹侧海马PKMζ在海马依赖性空间记忆中的作用**
在Y迷宫测试中，vHPC PKMζ KD小鼠与对照总路程和潜伏期均无差异，但对照小鼠在新臂花费的时间和路程显著多于熟悉臂，而PKMζ KD小鼠则无偏好，且新臂进入次数显著减少。结论：vHPC中PKMζ是海马依赖性空间记忆所必需的，但空间记忆受损与虚假恐惧无关。
#### 讨论与结论
讨论部分指出，本研究通过双向操作证实dHPC CA2/CA3区域中PKMζ的激酶活性作为分子刹车，限制虚假情境恐惧记忆在记忆再激活后的早期放大。PKMζ敲低或激酶失活突变增强放大，而野生型PKMζ过表达阻止放大，且初始表达不受影响，表明PKMζ调控的是再激活后的强化而非初始编码。这一机制可能通过稳定突触增强和限制记忆痕迹的失稳来发挥作用。与先前关于GR/MR信号的工作相结合，PKMζ可能参与应激激素受体信号下游的突触可塑性调节。
研究结论翻译如下：
“这些发现与以下可能性一致：dHPC中PKMζ的功能丧失以可能促进虚假情境恐惧的时间依赖性增加并损害空间识别记忆的方式影响情境记忆过程。” 此外，讨论还指出，虚假恐惧的早期放大可能类似于PTSD等状态下对部分重叠线索的过度反应，而dHPC CA2/CA3中的PKMζ活性可能是限制这种适应不良泛化的生物学机制。未来研究需在雌性小鼠中验证，并直接评估PKMζ对情境记忆精度的影响。
