《Frontiers in Microbiology》：Wastewater genomic surveillance identifies the emergence of the SARS-CoV-2 JN.1 lineage in urban settings of Gujarat
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废水流行病学（Wastewater-based epidemiology, WBE）已成为补充临床监测以追踪SARS-CoV-2传播及群体水平变异动态的关键流行病学工具。由于病毒脱落发生较早且独立于医疗寻求行为，WBE能够提供感染趋势和变异株出现的超前信号。本
废水流行病学（Wastewater-based epidemiology, WBE）已成为补充临床监测以追踪SARS-CoV-2传播及群体水平变异动态的关键流行病学工具。由于病毒脱落发生较早且独立于医疗寻求行为，WBE能够提供感染趋势和变异株出现的超前信号。本研究为一项纵向、多中心、定量和基因组监测研究，于2023年1月至2024年7月期间，利用艾哈迈达巴德、甘地讷格尔及瓦多达拉三个城市的废水样本开展SARS-CoV-2监测。研究人员采用数字PCR（digital PCR, dPCR）对2,130份废水样本进行病毒载量测定，随后对高滴度样本进行全基因组测序（whole genome sequencing, WGS）。结果显示，废水病毒基因组浓度与报告的临床COVID-19病例数具有强统计学相关性（Pearson相关系数r=0.898；p<0.001），可作为可靠的预测指标。废水在甘地讷格尔和瓦多达拉显示出1周滞后时间的最强预测价值，而艾哈迈达巴德则在2周滞后时显示统计学显著性。值得注意的是，基于丰度的优势度分析表明，废水监测还能预测优势变异株的变化。在艾哈迈达巴德，JN.1较临床样本提前1周被检出，而KP.x在艾哈迈达巴德的领先时间达3周。突变水平的时间映射也支持谱系定义性突变在废水中先于临床识别即已出现并维持，提示新变异株在群体水平上呈渐进式形成。本研究表明，综合性定量与基因组废水监测有助于早期检测社区中SARS-CoV-2的存在，并对社区内最常见变异株的变化形成前瞻性认知。这些结果凸显了废水监测作为敏感、可扩展且具前瞻性的群体健康工具，在疫情早期预警和防范方面的重要价值。
该论文发表于《Frontiers in Microbiology》，旨在探讨废水基因组监测在SARS-CoV-2变异株早期识别中的公共卫生价值。研究背景源于COVID-19大流行对全球健康造成的深远影响，以及传统临床监测面临的固有限制。疫情初期，临床检测能力有限且约30%的感染者呈无症状状态，导致病毒传播追踪和疾病负担评估困难。虽然SARS-CoV-2 primarily affects the respiratory system，但其可与胃肠道中的ACE2受体（angiotensin-converting enzyme 2 receptor）结合并经粪便排出，这为废水流行病学（WBE）应用于社区健康监测提供了理论基础。废水处理厂（Wastewater Treatment Plants, WWTPs）和泵站能够捕获来自有症状和无症状感染者的病毒脱落，包括临床症状出现前的脱落，从而实现对社区感染真实程度的估计。然而，废水基因组监测面临低病毒载量、RNA片段化以及高水平PCR抑制剂等技术挑战。数字PCR（dPCR）因其对稀有靶标的高灵敏度检测能力，正逐步取代RT-qPCR成为环境样本检测的新兴标准方法。全基因组测序（WGS）虽因废水样本中病毒谱系混合、核酸片段化等问题而颇具挑战，但可作为临床基因组监测的成本效益型替代或补充方案，提供特定区域内已知或未知病毒谱系的有价值信息。在此背景下，研究人员开展了这项综合性研究。
本次研究用到以下主要关键技术方法：采用PEG8000和NaCl法进行病毒富集，利用QIAamp Viral RNA mini Kits提取病毒RNA并以MS2噬菌体作为外源对照；采用QIAcuity One-5 plex dPCR系统进行SARS-CoV-2绝对定量；选取高病毒载量（>5,000 genome copies/L）及部分低载量样本，利用Illumina COVID-Seq Test结合ARTIC v5.4.2引物构建文库，在NovaSeq 6000平台进行2×150-bp paired-end测序；生物信息学分析采用Freyja pipeline（v1.4.8）进行谱系解卷积，并结合BWA-MEM比对、SAMtools处理及iVar变体calling；临床数据对比采用GISAID数据库中GBRC提交的1,765条SARS-CoV-2基因组序列；统计学分析采用Pearson相关和Spearman秩相关进行时间滞后分析。
研究结果部分包含以下主要内容：
dPCR检测性能与流程验证：研究人员通过MS2噬菌体外源对照评估流程回收效率，结果显示样本回收率在29.05%至64.75%之间，与既往研究相符。PCR抑制剂的高丰度可能影响MS2噬菌体的回收效率。通过10倍系列稀释确定检测限，1.2 copies/reaction浓度下仍可定量且变异系数（CV）≤20%，标准曲线R
2达0.9997。
古吉拉特邦各城市SARS-CoV-2废水动态及病例相关性：2023年1月至2024年7月期间，共处理2,130份废水样本。2023年2-3月出现病毒基因组载量显著升高，3月达峰。Pearson相关分析显示废水病毒基因组拷贝数与报告COVID-19病例呈强相关（r=0.898, p<0.001）。艾哈迈达巴德病毒RNA于2月下旬上升、3月中旬至4月第二周达峰；甘地讷格尔模式类似，最高平均浓度出现于3月16日（64,040 GC/L）和4月6日（56,163 GC/L）；瓦多达拉则在4月3日（98,582 GC/L）和4月20日（70,013 GC/L）达到峰值。2023年10月底出现再度上升，12月底出现明显峰值。2024年2月艾哈迈达巴德略升，甘地讷格尔和瓦多达拉呈下降趋势。Spearman滞后相关分析显示，甘地讷格尔和瓦多达拉1周滞后相关性最强（r=0.522, p=0.003；r=0.485, p=0.016），艾哈迈达巴德2周滞后显示统计学显著性（r=0.166, p=0.033）。
城市内采样点SARS-CoV-2病毒基因组载量比较：根据平均病毒基因组浓度将采样点分为高信号区和低信号区。艾哈迈达巴德Vasna MLD和Vasna SPS为最高信号区，Ambawadi最低；甘地讷格尔Raysan为最高信号点，Vavol最低；瓦多达拉Tarsali和21 Chhani为高信号区，Gajarawadi和Vemali最低。
SARS-CoV-2变异株分析：272份高载量样本进行测序，246份基因组覆盖度>50%的样本用于下游分析。Freyja pipeline识别出超过400个不同谱系，约47个为优势谱系。2023年2月BA.2.38为优势谱系（~19%），3-4月XBB.1.16及其亚谱系占主导，5月XBB.1.16.4达48%。6月起BA.2.38再度 prevalent（~22%）。11月首次在废水中检出JN变异株（minor proportions），12月JN.1、JN.1.1和JN.1.3在三城市均占major proportions。2024年2月KP.2（FLiRT variant）首现于瓦多达拉，4-7月JN.1、BA.2.38和BA.2.X共循环。与1,765条GISAID临床序列比较，JN.1在废水中第48周首现，较临床样本第51周提前3周检出；KP.x在甘地讷格尔亦提前3周。
谱系定义性SARS-CoV-2突变的时间映射：突变水平时间映射显示，谱系定义性突变在废水中先于临床识别即已存在。艾哈迈达巴德XBB衍生谱系相关突变间歇性或连续性出现；甘地讷格尔JN相关谱系突变提前数周出现；瓦多达拉XBB.1.16谱系基因在废水中的检测亦早于临床样本。
废水与临床样本SARS-CoV-2谱系相互关系分析：三城市废水与临床样本共有11个共同谱系，23个谱系仅见于所有城市废水样本，部分谱系为各城市废水或临床样本所独有。
讨论部分，研究人员指出废水监测作为群体水平监测平台，在低强度临床检测和高比例无症状感染报告不足的地区尤为重要。三城市一致的结果支持废水监测作为传统临床监测关键补充的价值。Pearson相关系数r=0.898（p<0.001）证实废水病毒载量有效代表社区传播趋势，废水病毒RNA增长先于或伴随临床报告病例增长，体现流行病学指示价值。与欧美研究一致，本研究将早期变异株识别扩展至印度城市背景。1-2周的领先时间与既往美国2-12天、亚洲14天的研究相符，反映前驱期和无症状感染者粪便病毒脱落的生物学特性。滞后相关性随滞后时间延长而减弱，表明废水信号最适合近期暴发预测而非长期预报。
城市间相关性强弱和最佳领先时间的差异可能归因于人口密度、污水管网结构、医疗寻求行为、流动趋势及临床检测实践等城市特异性因素，强调本地化校准在 operationalizing 废水监测中的必要性。dPCR的使用是本研究的重要方法学优势，其较RT-qPCR具有更高灵敏度、精密度和抗PCR抑制剂能力，对维持流行间期监测至关重要。废水测序获得的多种共循环谱系复合信号，易被临床单一致性基因组测序所忽略，Freyja等谱系解卷积工具可有效揭示群落水平的病毒多样性。
本研究证明废水监测可较临床监测提前数周识别新变异株，JN.1、KP.x及XBB相关谱系的提前检出支持其作为敏感性预测监测工具的价值。基于丰度的优势度分析进一步显示，废水监测不仅能早期检测新谱系，还能预测人群内变异株替换动态，具有重要公共卫生防范意义。突变持续存在数周的观象表明变异株在群体水平逐步建立后被临床监测捕获。仅见于废水的谱系可能反映无症状或轻症感染，而仅见于临床的谱系可能提示低流行簇或低粪便脱落感染。与GISAID临床基因组流行病学数据比较显示，XBB.1.16.5亚谱系于2023年3月即见于废水，早于4-5月临床样本；JN变异株11月以minor proportions见于废水，较临床样本提前约1个月，凸显WBE基因组监测对新兴变异株检测和追踪的重要性。与孟买同期的XBB.1.16及其亚谱系循环报告一致。
研究也承认存在局限性，包括缺乏废水稀释度、流量变异性和降雨调整数据。基因组覆盖度与病毒载量的正相关（r=0.532）强调RNA水平对测序质量的影响，标准化程序和采样系统的优化将进一步提升数据可读性和可比性。
研究结论为：本研究证明了综合性定量和基因组废水监测有助于早期检测社区中SARS-CoV-2的存在，并对社区内最常见变异株的变化形成前瞻性认知。这些结果凸显了废水监测作为敏感、可扩展且具前瞻性的群体健康工具，在疫情早期预警和防范方面的重要价值。
