香叶天竺葵精油对抗临床念珠菌和参考菌株：毒力抑制和治疗视角的见解

《Frontiers in Fungal Biology》：Pelargonium graveolens essential oil against clinical Candida and reference isolates: insights into virulence inhibition and therapeutic perspectives

　　

背景：念珠菌相关感染发病率的上升以及由生物膜形成驱动的持续抗真菌耐药性，凸显了对替代疗法的需求。精油作为多靶点天然抗真菌剂具有前景。本研究评估了通过水蒸气蒸馏法从埃杜格地区（阿尔及利亚安纳巴）地上部分获得的香叶天竺葵精油（PGEO）的抗真菌活性及其对人类细胞的影响。
方法：通过气相色谱-质谱联用（GC-MS）对PGEO（得率：0.23 ± 0.04% w/w）进行表征。其抗真菌活性针对五种临床念珠菌分离株（白色念珠菌、克菲念珠菌、克柔念珠菌（异名 Pichia kudriavzevii）、葡萄牙念珠菌、热带念珠菌）和参考菌株白色念珠菌ATCC 10231进行测试。通过固体培养基上的Pz/Hz指数评估对毒力酶（分泌型天冬氨酰蛋白酶、磷脂酶、酯酶、溶血素）的影响。使用结晶紫染色和代谢活力测定评估抗生物膜活性。在HEK-293人胚胎肾细胞中评估细胞毒性。
结果：PGEO主要包含香茅醇（28.68%）、香叶醇（5.35%）、异薄荷酮（5.44%）和芳樟醇（3.15%）。它表现出广谱抗真菌活性（最低抑菌浓度（MIC）：0.312–2.5 mg/mL；最低杀菌浓度（MFC）/MIC比值：2），包括对氟康唑耐药的克柔念珠菌。在亚抑菌浓度（MIC/4至MIC/2）下，PGEO抑制酶分泌21.30%至65.00%，取决于酶种类和物种，范围从21.30%（酯酶，克柔念珠菌）到65.00%（溶血素，白色念珠菌ATCC 10231），减少了念珠菌的粘附和侵袭。PGEO抑制生物膜形成（48.7–97.8%）和代谢活性（在MIC时降低43.2–82.1%）。在HEK-293细胞中的细胞毒性得出CC₅₀为3.99 ± 0.12 mg/mL，选择性指数（SI = CC₅₀/MIC）为1.59–12.79。
结论：香叶天竺葵精油对临床相关念珠菌物种（包括氟康唑耐药的克柔念珠菌）表现出强效的杀菌、抗生物膜和多靶点抗毒力活性，同时对正常哺乳动物细胞保持可接受的细胞毒性（CC₅₀ = 3.99 ± 0.12 mg/mL；SI：1.59–12.79）。其在亚抑菌浓度下同时抑制生长、关键毒力酶和生物膜形成，使PGEO成为用于局部或辅助治疗生物膜相关念珠菌病的有前景的天然候选物，有待体内验证。

念珠菌感染（尤其是由非白念珠菌物种如克柔念珠菌引起）的发病率和抗真菌耐药性持续上升，生物膜形成是主要驱动因素，导致临床治疗失败和复发。现有抗真菌药物如氟康唑存在窄谱、抑菌而非杀菌、耐药性积累等局限，亟需开发多靶点、低毒性的替代疗法。香叶天竺葵精油（PGEO）来源广泛，富含香茅醇和香叶醇等单萜醇，已知具有抗菌和抗炎活性，但以往研究多局限于基础抗真菌作用，缺乏对毒力抑制、抗生物膜和正常细胞毒性的综合评价。因此，研究人员开展本研究，旨在首次同时评估阿尔及利亚埃杜格地区PGEO对临床念珠菌分离株（包括氟康唑耐药菌株）的抗真菌、抗生物膜、抗毒力活性及对HEK-293人胚胎肾细胞的毒性，以探讨其作为局部或辅助治疗候选物的潜力。该论文发表在《Frontiers in Fungal Biology》。

研究人员采用以下关键方法：①通过水蒸气蒸馏法从香叶天竺葵地上部分提取PGEO，并用气相色谱-火焰离子化检测（GC-FID）和GC-MS分析化学成分；②采用琼脂扩散法和微量稀释法测定PGEO对六种念珠菌（五种临床分离株和白色念珠菌ATCC 10231参考菌株）的抑菌圈直径、最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MFC）；③通过固体培养基上的Pz/Hz指数评估PGEO在亚抑菌浓度（? MIC）下对四种毒力酶（磷脂酶、分泌型天冬氨酰蛋白酶SAP、酯酶、溶血素）的抑制活性；④使用结晶紫染色和XTT还原法测定PGEO对生物膜形成和代谢活力的抑制作用；⑤采用MTT法在HEK-293细胞中评估细胞毒性，计算半数抑制浓度（CC₅₀）和选择性指数（SI = CC₅₀/MIC）。

研究结果：

**3.1 香叶天竺葵精油的化学成分**
通过GC-MS分析，研究人员从70个检测峰中鉴定出58种化合物，占总成分的81.5%。主要成分为香茅醇（28.68%）、香叶醇（5.35%）、异薄荷酮（5.44%）和芳樟醇（3.15%），属于典型的地中海地区“非洲化学型”，单萜醇（37.72%）和氧化单萜（11.48%）占主导地位。

**3.2 抗真菌活性**
PGEO对六种念珠菌均表现出广谱抗真菌活性。抑菌圈直径（10 μL）范围从克柔念珠菌的15.7 ± 0.8 mm到白色念珠菌ATCC 10231的24.5 ± 1.2 mm。MIC范围为0.312–2.5 mg/mL，MFC/MIC比值均为2（≤4为杀菌作用），表明PGEO具有杀菌效应，且对氟康唑耐药克柔念珠菌仍有效。氟康唑阳性对照对克柔念珠菌无抑制（抑菌圈0 mm），而PGEO仍产生15.7 mm抑菌圈。

**3.3 生物膜形成的抑制：结晶紫生物量测定和代谢活力**
PGEO在MIC下抑制生物膜生物量（结晶紫法）48.67%–97.80%，其中白色念珠菌ATCC 10231抑制率最高（97.80%）。XTT法显示代谢活力降低43.20%–82.10%（MIC）。两法结果一致，呈浓度依赖性；即使在MIC/8下，PGEO仍保留部分抑制活性（CV法6.33%–18.40%）。对克柔念珠菌，PGEO在MIC下抑制生物膜约48.7% biomass和43.1%代谢活性，而氟康唑完全无效。

**3.4 念珠菌毒力酶分泌的抑制**
PGEO在? MIC下对四种毒力酶均表现出抑制活性。磷脂酶抑制率27.00%–58.00%，白色念珠菌ATCC 10231和临床分离株最强（Pz<0.40，强抑制），克柔念珠菌最弱（27.00%，中等抑制）。分泌型天冬氨酰蛋白酶（SAP）抑制率23.30%–62.00%，白色念珠菌ATCC 10231达62.00%，克柔念珠菌仅23.30%（弱抑制）。酯酶抑制率21.30%–55.00%，克柔念珠菌最低（21.30%），白色念珠菌ATCC 10231最高（55.00%）。溶血素抑制率27.13%–65.00%，白色念珠菌ATCC 10231达65.00%（强抑制），克柔念珠菌27.13%（中等抑制）。参考抑制剂（EDTA、胃蛋白酶抑制剂A、PMSF、热灭活）均实现>90%抑制，证实实验体系有效性。

**3.5 细胞毒性测定**
在HEK-293细胞中，PGEO在0.25–2 mg/mL浓度范围显示非细胞毒性（细胞活力>75%，符合ISO 10993-5标准），4 mg/mL时轻度细胞毒性（51.20%），6和8 mg/mL时细胞毒性（活力<50%）。CC₅₀为3.99 ± 0.12 mg/mL。选择性指数（SI = CC₅₀/MIC）因菌株而异：白色念珠菌ATCC 10231为12.79（优良），临床白色念珠菌、葡萄牙念珠菌、热带念珠菌均为6.38（良好），克菲念珠菌为3.19（中等），克柔念珠菌为1.59（狭窄）。

在讨论部分，研究人员指出PGEO的化学成分与北非来源报道一致，高含量氧化单萜赋予其强抗菌和酶抑制潜力。抗真菌活性优于或相当于已报道的香叶天竺葵精油，且对氟康唑耐药克柔念珠菌保持杀菌作用，归因于多靶点机制（如破坏膜完整性、干扰麦角甾醇合成）。抗生物膜活性优于多数唇形科精油，在亚抑菌浓度下仍有效，可能通过抑制Ras1/cAMP/PKA信号通路等分子机制发挥作用。抗毒力活性方面，PGEO同时抑制四种酶，尤其对溶血素和磷脂酶效果显著，这不同于常见仅评估一两种毒力因子的研究。细胞毒性数据显示良好选择性，非细胞毒性浓度（≤2 mg/mL）覆盖了四种最敏感菌株的MIC，提示局部使用安全性高。

研究结论翻译如下：
本研究证明，来自阿尔及利亚东北部的香叶天竺葵精油对相关念珠菌物种（包括氟康唑耐药菌株）具有显著的杀菌、抗生物膜和多靶点抗毒力活性。该精油在亚抑菌浓度下有效抑制关键毒力酶和生物膜形成，同时对正常HEK-293细胞保持有利的选择性（SI高达12.79）。这些发现强调了这种阿尔及利亚天竺葵精油作为天然替代品或辅助剂治疗生物膜相关念珠菌病的治疗潜力。建议未来进行体内研究和药物制剂研究，以期将这些有前景的体外结果转化为临床应用。