《Frontiers in Microbiology》：Metagenomics and metabolomics analyses of the mechanism of non-expression of natural mating behavior in captive male Malayan pangolins (Manis javanica)
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易地保护（ex situ conservation）和圈养繁殖（captive breeding）是保护濒危物种的重要措施。然而，一些野生动物（尤其是雄性）的繁殖在圈养条件下受到抑制，但其潜在机制尚未阐明。本研究旨在利用宏基因组学（metagenomics）和
易地保护（ex situ conservation）和圈养繁殖（captive breeding）是保护濒危物种的重要措施。然而，一些野生动物（尤其是雄性）的繁殖在圈养条件下受到抑制，但其潜在机制尚未阐明。本研究旨在利用宏基因组学（metagenomics）和代谢组学（metabolomics）分析，以具有正常（具有自然交配行为）和异常（无自然交配行为）繁殖能力的雄性马来穿山甲为研究对象，探究影响繁殖的微生物群及其功能、代谢物及其代谢途径。结果显示，异常繁殖（abnormal reproduction, AR）组中变形菌门（Proteobacteria）、大肠杆菌（Escherichia coli）和志贺氏菌属（Shigella spp.）的相对丰度显著升高。然而，正常繁殖（normal reproduction, NR）组中厚壁菌门（Firmicutes）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的相对丰度显著更高。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）功能通路富集分析发现，AR组穿山甲中柠檬酸循环（TCA cycle, KO00020）和丙酮酸代谢（KO00620）显著富集，而NR组穿山甲中促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone, GnRH）分泌（KO04929）显著富集。代谢物如色氨酸（tryptophan）、精氨酸（arginine）和雄激素（androgen）在AR组穿山甲中显著富集，而L-脯氨酸（L-proline）、牛磺酸（taurine）、胆碱（choline）和亚精胺（spermidine）在NR组穿山甲中显著富集。微生物失调（microbiota dysbiosis）、能量代谢紊乱（energy metabolism disorder）、关键代谢途径和代谢物缺乏以及激素紊乱都是导致雄性马来穿山甲无法表达自然繁殖行为的潜在因素。本研究为圈养穿山甲的异常繁殖（AR）提供了证据，并为圈养濒危物种的保护提供了重要见解。
论文解读：圈养雄性马来穿山甲自然交配行为不表达的宏基因组学与代谢组学机制研究研究背景与问题马来穿山甲（*Manis javanica*）是极度濒危物种，其圈养繁殖面临巨大挑战，尤其是雄性个体常无法表达自然交配行为，导致繁殖成功率极低。现有研究多集中于繁殖行为、激素监测和精子参数，但圈养状态下生殖抑制的生理和微生物机制尚未阐明。前人研究虽涉及穿山甲肠道微生物与食蚁适应、应激和免疫的关系，但未关注泌尿生殖道微生物及代谢物对繁殖异常的作用。因此，本研究旨在通过整合宏基因组学（metagenomics）和代谢组学（metabolomics），比较正常繁殖（NR）与异常繁殖（AR）雄性马来穿山甲的尿液微生物组成、功能通路及代谢物谱，揭示自然交配行为不表达的关键微生物类群、功能通路和代谢物，为圈养管理提供机制性见解。论文发表在《Frontiers in Microbiology》。
关键技术方法研究选取广西林业科学研究院穿山甲繁育基地的10只成年雄性马来穿山甲，分为NR组（5只，有成功自然交配经历）和AR组（5只，无成功自然交配经历）。主要技术包括：（1）尿液宏基因组测序（Illumina NovaSeq 6000平台），通过MEGAHIT组装、MetaGeneMark基因预测、DIAMOND比对NCBI NR数据库进行物种注释，并基于KEGG数据库进行功能通路富集分析；（2）非靶向代谢组学分析，采用液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）系统检测尿代谢物，经XCMS峰提取、OPLS-DA筛选差异代谢物，并结合KEGG注释进行代谢通路分析；（3）微生物与代谢物的联合相关性分析。
研究结果3.1 异常繁殖（AR）组穿山甲尿液微生物多样性更高且病原菌丰度增加通过Shannon和Simpson指数分析发现，AR组尿液微生物α多样性显著高于NR组（p<0.01）。主坐标分析（PCoA）和Adonis分析显示两组微生物β多样性存在显著分离（R2=0.059，p<0.01）。在门水平，AR组中变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidota）丰度显著升高，而NR组中厚壁菌门（Firmicutes）丰度更高。在属水平，NR组富集了葡萄球菌属（*Staphylococcus*）、迪茨氏菌属（*Dietzia*）、克雷伯氏菌属（*Klebsiella*）、乳杆菌属（*Lactobacillus*）等潜在有益菌；AR组则富集了棒状杆菌属（*Corynebacterium*）、短杆菌属（*Brevibacterium*）、埃希氏菌属（*Escherichia*）、颤杆菌属（*Oscillibacter*）等条件致病菌。在种水平，AR组致病性大肠杆菌（*E. coli*）和粪肠球菌（*Enterococcus faecalis*）显著增多，而NR组金黄色葡萄球菌（*S. aureus*）和科氏葡萄球菌（*S. cohnii*）丰度更高。
3.2 能量代谢通路在AR组穿山甲中显著富集，而促性腺激素释放激素（GnRH）分泌和神经突触通路在NR组中优先活跃基于KEGG功能注释，PCoA分析显示两组微生物功能基因组成存在显著分离（Adonis R2=0.171，p<0.01）。在KEGG三级通路水平，NR组显著富集了多巴胺能突触（KO04728）、胆碱能突触（KO04725）、血清素能突触（KO04726）、GnRH分泌（KO04929）和长期抑制（KO04730）等通路；而AR组显著富集了柠檬酸循环（TCA循环，KO00020）、丙酮酸代谢（KO00620）、GABA能突触（KO04727）、致病性大肠杆菌感染（KO05130）和色氨酸代谢（KO00380）等通路。进一步分析KEGG模块发现，AR组中糖酵解（M00001）、糖异生（M00003）、TCA循环（M00009）和β-氧化（M00087）等能量代谢模块显著富集，提示能量代谢代偿性上调。
3.3 NR组穿山甲富含生殖有益代谢物，而AR组呈现激素和代谢紊乱非靶向代谢组学共鉴定9,596种代谢物，其中3,198种在两组间显著差异。NR组中乙酰胆碱、N-乙酰血清素（NAS）、亚精胺、牛磺酸、L-脯氨酸、丙酮酸、胆碱和甜菜碱等代谢物显著富集，这些物质被认为与神经活性、生殖支持和抗应激相关。AR组中色氨酸、犬尿氨酸、精氨酸、雄酮、睾酮、脱氢表雄酮、雌酮、雄烯二酮等代谢物显著升高，表明雄激素和雌激素代谢紊乱。KEGG模块分析显示，AR组中多胺生物合成（精氨酸≥胍丁胺≥腐胺≥亚精胺，M00133）显著富集，但亚精胺水平低于NR组；色氨酸代谢（色氨酸≥犬尿氨酸≥2-氨基粘康酸，M00038）在AR组活跃，而褪黑素生物合成（色氨酸≥血清素≥褪黑素，M00037）在NR组显著富集。两组在C19-甾体激素合成通路（包括雄激素回补途径和经典途径）上无显著差异，但AR组中雄酮和睾酮的代谢效率可能较低。
3.4 微生物群落与代谢物的联合分析相关性分析表明，有益代谢物（如GABA、亚精胺、牛磺酸、L-脯氨酸、丙酮酸）与乳杆菌属（*Lactobacillus*）呈正相关，与致病菌（如*E. coli*、金黄色葡萄球菌、棒状杆菌属等）呈负相关；而丙烯酰胺、谷氨酸、精氨酸等与上述微生物呈相反的相关模式，提示微生物失调直接关联代谢紊乱。
总结与讨论研究人员在讨论中整合了微生物、代谢和神经内分泌视角：AR组尿液微生物α多样性升高且富集病原菌（如变形菌门、*E. coli*、志贺氏菌属），与泌尿生殖道炎症和免疫应答有关；能量代谢通路（TCA循环、丙酮酸代谢）虽代偿性富集，但底物（如丙酮酸）水平降低，提示能量供应不足，可能抑制生殖行为；NR组中GnRH分泌通路和神经递质（多巴胺、乙酰胆碱）相关代谢物富集，支持其生殖功能正常，而AR组中GnRH分泌减少及色氨酸-犬尿氨酸通路过度激活可能抑制下丘脑-垂体-性腺轴；精氨酸代谢效率低下和雄激素水平紊乱也参与了繁殖障碍。尽管样本量有限且部分推论基于其他哺乳动物，本研究首次从尿液微生物组和代谢组层面揭示了圈养雄性马来穿山甲繁殖异常的潜在机制。
结论翻译总之，本研究揭示了异常繁殖（AR）组的一系列显著差异：（1）AR组潜在有益菌和有害菌的结构显著改变，有害菌（如变形菌门、志贺氏菌属、沙门氏菌属、*E. coli*和*E. faecalis*等）丰度增加，可能诱发炎症和抑郁，部分微生物甚至与不利于繁殖的因素相关，但这一关联需在更大样本和动态研究中进一步验证。（2）AR组的代谢组学分析显示能量代谢通路（如TCA循环和丙酮酸代谢）富集，但相关底物（如丙酮酸）水平下降，呈现“高富集但底物不足”现象，可能暗示能量代谢失衡，该结果需通过能量物质的精确测量和功能实验进一步研究。（3）AR组中雄激素代谢和信号通路显著紊乱：GnRH分泌减少，雄酮和睾酮的代谢效率相对较低，这些生理假设需通过激素水平和行为实验进一步验证。（4）AR组可能与精氨酸代谢紊乱相关，但相关性和因果机制仍不清楚，需进一步的功能研究确认。这些发现突出了AR组在微生物群落和宿主代谢层面的特殊变化，为雄性繁殖异常机制的研究提供了新视角；同时，由于样本量和条件的限制，所有结论需在更多研究中进一步验证和补充。
