针对PRRSV经典株、高致病性毒株及NADC30类似株的更新型一步法多重RT-qPCR检测方法

《Frontiers in Microbiology》：The updated one-step multiplex RT-qPCR method for PRRSV classical strains, highly pathogenic strains and NADC30-like strains

　　

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种高度接触性传染病，其主要临床症状包括母猪繁殖障碍和新生仔猪呼吸道疾病。自20世纪80年代末首次报道以来，PRRS已成为全球养猪业经济损失最严重的疾病之一。PRRSV属于动脉炎病毒科（Arteriviridae）β动脉炎病毒属，为单股正链RNA病毒，基因组大小约15 kb，含有至少10个开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）。依据国际病毒分类委员会（International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV）标准，PRRSV分为两个基因型：β动脉炎病毒1型（PRRSV-1，欧洲型）和β动脉炎病毒2型（PRRSV-2，北美型），两基因型核苷酸相似性约60%。

1996年，中国首次分离到PRRSV毒株CH-1a，标志着经典美洲型毒株（Classical PRRSV, C-PRRSV）在中国开始流行。2006年，高致病性PRRSV变异株（Highly Pathogenic PRRSV, HP-PRRSV）被发现，该毒株以高热、高发病率和高死亡率为特征，其nsp2区域存在30个氨基酸的不连续缺失，导致毒力显著增强。2012年，类NADC30毒株（NADC30-like）在中国首次报道，该毒株与美国2008年分离的NADC30毒株高度同源，其nsp2基因存在131个氨基酸的不连续缺失。基于ORF5基因的系统进化分析，中国流行的PRRSV-2可分为多个谱系，主要包括谱系1（L1.8/NADC30-like和L1.5/NADC34-like）、谱系3（L3/QYYZ-like）、谱系5（L5.1/VR2332-like）和谱系8（L8.7/JXA1-like和L8/CH-1a-like）。近年来，NADC30类毒株已演化为中国猪群中的优势流行株，该毒株具有极高的重组频率，易与其他谱系毒株发生基因重组，表现出强大的遗传进化能力。

目前，PRRSV变异株的鉴定主要依赖基于ORF5或nsp2基因的测序和进化分析，虽然准确但操作复杂、耗时较长，难以满足临床暴发的快速检测需求。与ORF5相比，nsp2基因包含毒株特异性的不连续缺失模式（如HP-PRRSV的30-aa缺失和NADC30-like毒株的131-aa缺失），为三种亚型的鉴别提供了更高分辨率。荧光定量PCR（Fluorescence Quantitative PCR, qPCR）技术因其灵敏性、特异性和高通量特点，已成为PRRSV检测的重要手段。然而，随着PRRSV-2的不断突变重组，现有方法的检测靶标可能与田间流行毒株不匹配，导致假阴性和漏检风险。因此，追踪田间毒株进化动态、定期更新引物和探针对确保诊断准确性至关重要。

研究人员从GenBank下载大量PRRSV序列，结合实验室分离株的全基因组数据，通过序列比对分析筛选出保守且分型特异的靶标，成功建立了可同时检测NADC30-like毒株、高致病性毒株和经典毒株的新型一步法多重RT-qPCR方法，旨在为中国PRRSV的精准诊断、流行病学追踪和防控决策提供可靠技术工具。

该研究发表于《Frontiers in Microbiology》，聚焦于猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的分子诊断技术创新。研究背景方面，猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）自20世纪80年代末首次报道以来，已成为全球养猪业经济损失最严重的疾病之一。PRRSV属于动脉炎病毒科（Arteriviridae）β动脉炎病毒属（Betaarterivirus），为单股正链RNA病毒。该病毒分为PRRSV-1（欧洲型）和PRRSV-2（北美型）两个基因型，其中PRRSV-2在中国流行。1996年经典株（C-PRRSV）CH-1a的分离标志着PRRSV-2在中国流行的开始；2006年高致病性毒株（HP-PRRSV）出现，其nsp2区域存在30个氨基酸（aa）的不连续缺失；2012年类NADC30毒株（NADC30-like）首次报道，其nsp2基因存在131个氨基酸的不连续缺失。近年来，NADC30-like毒株凭借其极强的重组能力和适应性优势，逐渐取代HP-PRRSV成为中国猪群中的优势流行株，但HP-PRRSV和C-PRRSV仍在部分猪场零星发生，使得中国PRRSV的遗传背景日趋复杂。现有RT-qPCR检测方法因病毒持续突变重组而面临假阴性风险增加的问题，及时更新引物和探针序列对保证诊断准确性至关重要。

研究人员开展了针对PRRSV三种主要流行毒株的一步法多重RT-qPCR检测方法的建立与评价研究。通过从NCBI下载最新流行毒株全基因组序列并结合实验室分离株数据，在nsp2基因高变区筛选保守且分型特异的靶标区域，设计TaqMan MGB探针和引物，优化反应条件后对该方法的标准曲线、扩增效率、灵敏度、特异性、重复性及临床应用效果进行系统评价。研究结论表明，该方法具有高灵敏度、强特异性和良好的重复性，可用于临床样本中三种PRRSV亚型的快速鉴别诊断，为中国PRRSV的精准诊断、流行病学监测和防控提供可靠技术工具。

研究采用的主要关键技术方法包括：基于GenBank数据库和实验室分离株的全基因组序列比对分析，利用Megalign软件进行多序列比对，使用Primer Premier 5.0和PrimerSelect软件设计并筛选引物和TaqMan MGB探针；构建重组质粒标准品并建立标准曲线；通过优化引物浓度、探针浓度和退火温度确定最佳反应条件；采用Probit回归分析确定最低检测限；以588份来自江苏、浙江等地规模化猪场的临床样本（包括鼻拭子、血清和组织样品）进行临床应用评价，并与已报道的RT-qPCR方法进行平行检测比较。

研究结果部分，反应条件优化结果显示，当C-PRRSV、PRRSV-NADC30-like和HP-PRRSV的引物终浓度分别为0.4、0.5和0.2 μM，探针终浓度分别为0.2、0.1和0.4 μM，退火温度为59°C时，扩增效果最佳，Ct值较小且扩增效率较高。标准曲线结果显示，在1 × 10⁸至1 × 10³ copies/μL范围内，三种毒株检测的标准曲线均呈良好线性关系，R²均为0.998，扩增效率分别为98.383%、103.532%和97.577%，均处于理想的90%-110%扩增效率范围内。灵敏度检测结果显示，初步检测表明10 copies均可检出，进一步经Probit回归分析确定，在95%置信区间内，C-PRRSV、PRRSV-NADC30-like和HP-PRRSV的最低检测限分别为10.128 copies、8.458 copies和8.998 copies，表明该方法灵敏度较高。特异性检测结果显示，该方法仅对C-PRRSV、PRRSV-NADC30-like和HP-PRRSV阳性对照出现特异性扩增曲线，与PRRSV-1、PCV2、CSFV、PRV、PPV、PEDV、猪链球菌（S. suis）和副猪格拉瑟菌（G. parasuis）等常见猪病原无交叉反应，特异性良好。重复性检测结果显示，批内变异系数（CV）范围为0.18%-1.71%，批间变异系数范围为0.28%-1.09%，均小于2%，表明该方法具有良好的稳定性和重复性。临床样本检测结果显示，588份临床样本中，本方法检出PRRSV阳性91份，阳性率为15.5%，高于已报道方法13.94%的阳性检出率；其中HP-PRRSV阳性14份（2.4%）、C-PRRSV阳性3份（0.5%）、PRRSV-NADC30-like阳性74份（12.59%）。两种方法的Kappa值为0.87，一致性几乎完美。对检测结果存在差异的扩增产物进行测序发现，已报道方法未能检出的样本是因部分碱基序列发生突变所致。

讨论部分，研究人员指出PRRS作为全球养猪业经济损失最严重的病毒性疾病之一，其精准分型诊断是制定科学防控策略的前提。PRRSV尤其是nsp2基因高变区的遗传变异为不同毒株的分类鉴定提供了分子基础：HP-PRRSV具有30个氨基酸（481位、534-562位）的不连续缺失，NADC30-like毒株具有131个氨基酸（322-432位、483位、504-522位）的不连续缺失。然而，由于该区域高度可变且NADC30-like毒株易与其他谱系毒株发生突变或重组，序列呈现高度多样性。本研究在设计引物和探针时刻意避开nsp2基因已知的重组热点区域（如NADC30-like毒株常见的322-432位和504-522位缺失区域），选择这些热点侧翼相对保守的区域作为引物和探针结合位点，以确保对不同重组毒株的检测稳定性。

研究人员强调，若引物和探针设计基于较早的参考序列，随着流行毒株的持续突变，检测靶标与田间毒株的匹配度将逐渐下降，从而产生假阴性结果。因此，持续监测流行毒株遗传序列变化、定期更新荧光定量PCR方法的引物和探针对临床诊断准确性至关重要。本研究结合GenBank大量流行毒株序列与实验室最新田间分离株基因组数据，通过系统比对分析，在nsp2基因区域筛选出各毒株保守且分型特异的三个靶标区域，更新设计了引物和TaqMan MGB探针，成功建立了可同时检测三种毒株的一步法多重RT-qPCR方法。该方法能在单一反应管内实现三种毒株的鉴别检测，具有操作简便、检测通量高、污染风险低的特点。

在方法性能比较方面，研究人员指出本方法最低检测限与既往报道方法相当或更优，但强调不同方法检测限的比较受样本类型、标准质粒制备和反应体系条件等因素影响，应谨慎解读。临床样本检测中，本方法阳性检出率高于已报道方法，推测是因部分样本在已报道方法的引物或探针结合区域发生碱基突变，导致引物或探针无法与靶序列结合。这充分说明及时更新引物和探针以匹配当前流行毒株序列的重要性，也反映了PRRSV变异对诊断方法时效性的严峻挑战。

基于临床样本分型结果，91份阳性样本中NADC30-like毒株占81.31%、HP-PRRSV占15.38%、C-PRRSV占3.3%，与中国近年PRRSV流行病学调查总体趋势一致。多项研究证实NADC30-like毒株已成为中国当前猪群中的优势流行株，非重组NADC30-like毒株几乎消失，绝大多数流行毒株已发生重组事件。同时，HP-PRRSV仍在一定比例猪场中存在，尤其在无疫苗免疫或免疫程序不合理的猪场仍可引发暴发性流行；经典毒株虽然检出率较低，但其基因组片段仍可能存在于各种重组毒株中，持续监测其流行情况对理解病毒进化规律同样具有重要意义。

研究人员还讨论了混合感染和重组毒株检测的问题。尽管本研究中未观察到同一反应中的双阳性信号，但其他地区研究检测到谱系8与PRRSV-1的混合感染，提示中国部分地区确实存在混合感染现象。鉴于NADC30-like毒株的高频重组特性，本研究样本中不能排除重组毒株的存在。由于该方法针对三种原型毒株设计，对于重组毒株可能出现双阳性或异常信号强度，这为未来重组毒株的筛查和鉴定提供重要线索；但该方法检测非典型重组毒株或新型变异株的能力仍需进一步验证。

研究结论部分翻译如下：本研究更新并建立了一种可同时检测PRRSV经典毒株、高致病性毒株和NADC30-like毒株的一步法多重RT-qPCR方法。该方法灵敏度高、特异性强、重复性好，临床应用效果良好，为PRRSV的精准诊断和流行病学监测提供了可靠的技术工具。