竹叶花椒(Zanthoxylum armatum)全转录组测序：对代谢通路分析及调控的启示

《Frontiers in Plant Science》：Whole transcriptome sequencing from Zanthoxylum armatum: implications on metabolic pathway analysis and regulation

　　

研究人员对传统药用植物竹叶花椒(Zanthoxylum armatum)——一种落叶芳香灌木，传统上被用于治疗多种疾病——开展了转录组解析及叶片、茎和果实不同季节中小檗碱(berberine)和血根碱(sanguinarine)推定生物合成通路基因的表达研究，并鉴定参与异喹啉生物碱(isoquinoline alkaloids, IAs)生物合成的转录因子(transcription factor, TF)家族。各样品拼接转录本经聚类后，果实、叶和茎样品分别得到44254、46402和46521条unigene(独特基因)，并分别从这些unigene中预测出32118、27777和19754个编码序列(coding sequence, CDS)。利用MISA软件从果实、叶和茎样品中共鉴定出5576个简单序列重复(simple sequence repeat, SSR，即微卫星)，其中含侧翼序列150 bp的有1877个SSR。推定生物合成通路基因如BBE(Berberine Bridge Enzyme，小檗碱桥酶)、BBE-like、SOMT((S)-scoulerine 9-O-methyltransferase)、(S)-canadine synthase(CAS)、(S)-tetrahydroprotoberberine oxidase(STOX)、berberine synthase(BS)及sanguinarine reductase(SR)在三个样品不同季节均有显著表达且水平各异。转录因子分析及相关矩阵预测到丰度最高的TF家族依次为AP2/ERF家族(4010个)、MYB-related家族(3010个)、RPL2家族(2760个)、MYC家族(2662个)、DREB/CRF家族(2526个)和RAV(2302个)，WRKY亦参与其中。竹叶花椒代谢组与拼接转录组的关联分析将助力于通过人工智能(artificial intelligence, AI)引导启动(priming)实现物种的重新设计。所鉴定的TF可用于基于人工智能设计高效微型启动子(minipromoter)，以更可控可预测地提高目标化合物的产量。

竹叶花椒(Zanthoxylum armatum)全转录组及异喹啉生物碱生物合成通路与转录调控研究解读

研究背景与目的

竹叶花椒（Zanthoxylum armatumDC.）为芸香科（Rutaceae）落叶灌木或小乔木，传统上广泛用于治疗心血管疾患、骨伤、牙痛及炎症等，其活性成分小檗碱（berberine，原小檗碱型苄基异喹啉生物碱 benzylisoquinoline alkaloid, BIA）和血根碱（sanguinarine，苯并[c]菲啶型 BIA）具有重要药理价值。此前虽有花椒属花发育、萜类和黄酮类代谢的转录组报道，但缺乏针对Z. armatum中小檗碱与血根碱完整生物合成通路推定基因在不同组织、不同季节的表达普查，以及系统性鉴定调控这些通路的关键转录因子（transcription factor, TF）家族的研究。明确这些基因的组织/季节表达模式及关联的TF，可为后续利用合成生物学手段（如AI辅助设计微型启动子 minipromoter 及纳米载体介导的代谢工程）提升目标生物碱产量提供分子基础。本研究因此以Z. armatum叶片、茎和果实为材料，开展de novo转录组测序、功能注释、简单序列重复（simple sequence repeat, SSR）开发、差异表达分析、生物碱及中间代谢物定量，并鉴定参与异喹啉生物碱生物合成的TF家族及其与通路基因的相关性。

主要关键技术方法

研究人员采集印度地区Zanthoxylum armatum植株春季、夏季（幼绿果期）、季风季（成熟果期）和冬季的叶片、茎及果实，液氮速冻保存。提取总RNA构建链特异性mRNA文库，于Illumina HiSeq 2500平台进行双端（paired-end, PE）测序。原始数据过滤后用Trinity(v2.8.5)做de novo组装，CD-HIT去冗余获unigene，TransDecoder(v5.5.0)预测CDS并进行NR、UniProt、KOG、Pfam数据库BLAST比对注释，Blast2GO做基因本体（gene ontology, GO）注释，KAAS做KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路注释。MISA鉴定CDS中SSR。各组织读数（reads）回贴至CDS，用edgeR或DESeq2做差异表达分析（differential expression gene, DEG），限定|log₂FC|>1且p<0.05。PlantTFDB(v5)比对鉴定TF家族。采用HPLC-DAD定量检测小檗碱、血根碱及其中间体（reticuline、canadine、stylopine、dihydrosanguinarine）。qRT-PCR验证选定DEG及生物合成通路基因表达，内参为GAPDH和18S rRNA。

研究结果

RNA提取与文库构建（RNA extraction and library preparation）

果实、叶、茎样品分别获得约6.7 Gb、7.0 Gb和5.9 Gb高质量（HQ）清洗数据，平均文库插入片段分别为413 bp、401 bp和419 bp。数据已上传NCBI（BioProject ID: PRJNA1146397）。

De novo组装、Unigene与CDS预测（De novo assembly, unigenes and CDS prediction from master assembly）

三组织混合拼接得到164,899条转录本（N50=1848 bp），去冗余后获137,177条unigene（N50=1727 bp，平均长1108 bp）。从中预测出79,649条CDS（平均长888 bp）。NR库注释成功率92.97%（74,049条），UniProt注释60,331条，KOG 38,489条，Pfam 38,111条。BLAST最高同源种为甜橙（Citrus sinensis）和克里曼丁橘（Citrus clementina）。注释发现17条unigene编码小檗碱桥酶（berberine bridge enzyme, BBE）推定CDS，2条unigene编码血根碱还原酶（sanguinarine reductase, SR）推定CDS。

SSR鉴定（SSR identification from CDS）

自79,649条CDS中检出5,576个SSR，分布于4,793条序列中（646条含>1个SSR，443个为复合SSR）。重复单元数以三核苷酸（4,606个）为主，二核苷酸734个，六核苷酸200个，四、五核苷酸极少（20和16个）。其中1,877个SSR具上下游各150 bp侧翼序列可用于引物设计。

目标代谢物产量测定（Production of pathway marker compounds）

HPLC定量显示：小檗碱含量为茎(19.67±1.25 mg/gDW) > 叶(14.10±0.25 mg/gDW) > 果(2.26±1.41 mg/gDW)；血根碱含量为叶(9.01±1.12 mg/gDW) > 茎(6.85±1.25 mg/gDW) > 果(3.12±1.2 mg/gDW)。季节上，小檗碱与血根碱均在夏季最高（分别达18.16和7.65 mg/gDW），冬季最低（约2.23和2.85 mg/gDW）。中间代谢物reticuline在茎中最高，canadine在茎和果中较高，berberine在茎叶显著高于果；血根碱途径中间体stylopine在茎中较高，dihydrosanguinarine在叶中较高，终产物sanguinarine在叶中最丰富。整体次生代谢物合成呈现明显夏季升高、冬季降低的季节节律。

差异表达分析（Differential expression analysis of DEGs）

以Leaf vs Stem、Leaf vs Fruit、Stem vs Fruit组合比较，分别获显著上/下调基因1,309/1,629、4,657/6,848和3,791/5,621条。小檗碱途径基因BBE、SOMT、CAS、STOX、BS及BBE-like在各季节均于叶中相对高表达；血根碱途径CFS、SR及MYB-related在叶中上调，而TNMT、P6H、MSH、DBOX、STS在果实中有不同程度上调。激素相关基因（NCED、AAO1、AAO3、ACS、ACO、AHP、OPR等）及脂肪酸β-氧化相关基因（LACS、ACX、MFP2、HADH、ACAT2等）在不同组织呈现特异性差异表达，如KAS、KASI、AAD5（酰基-ACP去饱和酶5, Acyl-ACP Desaturase 5）在果中特异上调。

转录因子鉴定（Identification of transcription factor）

42,177条CDS编码TF，归属于64个TF家族（其余34个小家族归为Others）。最丰富的六大TF家族依次为AP2/ERF(4010)、MYB-related(3010)、RPL2(2760)、MYC(2662)、DREB/CRF(2526)、RAV(2302)，WRKY亦被检出（200个CDS含WRKY结构域）。相关性矩阵表明：MIKC-MADS、M-type-MADS、RAV、DREB/CRF、MYB-related及WRKY与小檗碱途径基因（BBE、SOMT、CAS、BBE-like、CFS）呈正相关；bHLH、bZIP、C3H、AP2/ERF、GID与血根碱途径部分基因（STOX、DBOX、P6H、MSH、TNMT、STS）呈正相关，提示这些TF可能协同调控异喹啉生物碱的生物合成。

qRT-PCR验证（qRT-PCR analysis）

对50个选定DEG进行qRT-PCR，其中BBE-like、TUBB（tubulin β chain）、RPL2（ribosomal protein L2）、MYB-related、BBE、SR验证结果与转录组趋势一致，全转录组预测log₂FC与qRT-PCR log₂FC线性回归R²=0.8154，证实转录组数据可靠。BBE在全年各采样期叶中表达最高（冬季各组织趋近），SR同样在叶中相对高表达。

讨论与结论（总结翻译）

研究人员通过对Zanthoxylum armatum叶、茎和果实的de novo转录组分析，获得了137,177条unigene和79,649条CDS，成功注释了参与小檗碱（BBE）和血根碱（SR）推定生物合成通路的基因，并在不同组织与季节验证了它们的差异性表达。鉴定出以AP2/ERF、MYB-related、RPL2、MYC、DREB/CRF、RAV及WRKY为主的TF家族，相关性分析揭示其与BIA生物合成基因的正向共调控关系。此外开发了具引物设计潜力的SSR标记。该研究提供的转录及功能注释资源、鉴定出的生物碱合成关键基因及关联TF，为今后利用AI设计minipromoter、基因编辑及细胞培养等手段提升Z. armatum中药用生物碱的合成与积累奠定了理论与数据基础。