综述：废水系统中西尼罗病毒RNA的环境赋存与归趋

《Frontiers in Environmental Science》：Environmental occurrence and fate of west nile virus RNA in wastewater systems

　　

西尼罗病毒（West Nile virus, WNV）是一种蚊媒黄病毒（flavivirus），已在全球范围内成为重要的公共卫生关切。越来越多的证据表明，WNV也可通过尿液排出，这增加了其经由环境介质扩散的可能性。因此，污水处理厂成为研究WNV存在与持久性的重要场所。本综述讨论了现有关于WNV在人类及动物宿主中传播的信息、病毒RNA在废水及类似基质中的检出情况，以及废水处理方法对病毒灭活或去除的效果。同时，研究还探讨了温度、pH、有机物含量和微生物活性等环境参数对WNV稳定性与感染性的影响。文中亦讨论了WNV病毒RNA的检测方法，重点关注尿液与环境样本中的病毒载量。最后，提出了未来研究方向，旨在将其他生物污染物的环境监测整合至现有基础设施中，以支持相关环境风险评估。

1 引言

西尼罗病毒（WNV）于1937年首次在乌干达西尼罗地区被发现，属于黄病毒科（Flaviviridae），是一种周期性在全球出现的虫媒病毒性人畜共患病。该病毒呈包膜结构，拥有约11 kb的单链RNA基因组，在遗传特征上与寨卡病毒（ZIKV）、登革病毒和日本脑炎病毒等其他虫媒病毒相似。WNV的生物循环涉及扩增宿主（主要为野生鸟类）和节肢动物媒介（主要是库蚊属Culex spp.）。某些嗜鸟蚊种在维持病毒的季节性存活与地理循环中发挥关键作用。人类和马等哺乳动物属于偶然的终末宿主，因其产生的病毒血症水平不足以感染新的蚊虫。临床上，约75%至80%的人类感染为无症状感染。约20%的病例表现为非特异性症状，如发热、不适、头痛、肌痛和皮疹。少数（<1%）感染者，尤其是免疫功能低下者和老年人，可能进展为严重的神经侵袭性疾病，包括脑炎、脑膜炎、吉兰-巴雷综合征和急性弛缓性麻痹，此类感染可能导致长期神经后遗症甚至死亡。WNV已进化出多种机制来调节宿主免疫反应，包括干扰干扰素信号通路，从而促进其在宿主体内的持续存在。WNV的传播受环境、生态和宿主相关因素的复杂相互作用影响，包括气候变化、媒介动态和社会经济条件，这些驱动因素共同导致了传播模式的时空异质性。疫情通常发生在夏末和秋季，此时媒介活动最为活跃。北半球温带地区受影响最严重的国家包括意大利、法国、西班牙、希腊、罗马尼亚和塞尔维亚。自1999年以来，WNV已在美国呈地方性流行，每年均有数千例病例报告。WNV主要分为两个系统发育谱系：谱系1主要导致欧洲和美洲的流行；谱系2曾局限于撒哈拉以南非洲地区，现已成为中东欧地区的流行株，且已被证实与严重的神经侵袭性暴发相关。在地中海地区和东欧，近年来的WNV传播已导致1055例确诊病例，病死率约为9%，这一数值与2023年至2025年间15至64岁年龄组SARS-CoV-2的病死率相当。尽管两者监测系统不同，但这一比较表明，WNV在临床发病时的致死负担可与重大呼吸道大流行相提并论。传统的虫媒和临床监测虽具流行病学意义，但近期报告显示，WNV可经尿液排出，并在较小程度上经动物粪便排出。鉴于无症状感染比例较高，这一发现凸显了废水环境监测（Wastewater-Based Environmental Surveillance, WBES）的重要潜力，因为大量感染者可能无法被临床报告系统捕获，但仍会排出病毒。COVID-19大流行期间对水、土壤和表面等环境介质中病毒的研究表明，监测废水可预测人群暴发。SARS-CoV-2 RNA在废水中的检出，包括对无症状感染者排出的病毒的检测，使得感染趋势和新兴变异株的早期识别成为可能，往往早于临床数据。这些进展凸显了WBES作为传染病早期预警系统的潜力。在此背景下，将此类方法推广至WNV等其他病毒病原体，代表了一种前景广阔但尚未充分探索的机会，有助于提升环境监测与公共卫生应急准备能力。事实上，近期已在废水固体中检测到WNV RNA，这表明尽管尚未证实粪口传播途径，但环境监测具有可行性。由于WNV可在尿液中长期排出，废水可作为流行病学指标，识别病毒循环的初始迹象。然而，废水中WNV的分子分析面临诸多方法学挑战，包括病毒载量低、RNA降解和PCR抑制剂干扰。尽管如此，北美、欧洲和亚洲的研究均已证明，在流行病暴发期间，从污水处理厂（WWTFs）的环境样本中检测出WNV RNA是可行的。本综述旨在批判性地评估现有文献，具体目标包括：明确WNV经尿液等途径进入环境的排泄路径；讨论WNV在城市废水中检出的证据；评估用于其检测的分析与采样方法；考察WWTF处理工艺对WNV的去除效果；探究影响病毒存活的关键环境因素；以及探讨工作局限性与未来展望。

2 WNV的传播途径

过去二十年间，科学界对WNV排泄途径的理解不断深入。尽管WNV主要通过感染库蚊属蚊虫叮咬传播，多项研究证实该病毒也可经体液（如尿液）排出，粪便排出则相对较少，且尚未证实由此导致的传播。这对发病机制和环境监测均具有重要意义。最早关于WNV尿排泄的系统报告来自仓鼠模型研究，实验感染金黄地鼠（Mesocricetus auratus）后，可发展为持续性肾脏感染，并在感染后长达8个月内持续经尿液排出感染性病毒，病毒分离结果经直接尿液培养和肾组织共培养证实，最长可达感染后247天。随后在鸣禽和鸦科鸟类等鸟类模型中观察到类似的动力学特征，表现为长期排毒、存在感染性病毒颗粒以及可通过RT-PCR和直接病毒分离检测到可测量的病毒滴度。鸦科鸟类作为知名的扩增宿主，其对湿地和城市地区环境污染的贡献已在文献中得到强调。WNV在尿液中的存在也在人类中得到证实，包括有症状和无症状个体，且有证据表明其具有长期持续性。研究报道，即使在无症状或轻症受试者中也能检测到病毒RNA。更有研究记录到WNV在尿液中的持续存在可长达数年，甚至在初次感染后9年仍可检出。这一发现提示，尿中长期存在的病毒可能是感染的长期标志物，不仅对诊断有价值，也可用于回顾性流行病学研究或高危人群筛查。在分子水平上，推测病毒通过全身播散到达泌尿道，随后在肾脏（尤其是近端小管）内复制。大量研究关注尿源性病毒颗粒的感染性问题，多个动物模型证实了病毒颗粒的完整性和复制能力。然而，缺乏令人信服的证据表明人类可通过尿液发生人际传播，这使得该途径相较于器官移植、输血或母婴传播等其他途径而言，是一种可能性较低的直接传染机制。不过，就废水污染而言，病毒RNA的持续释放仍是一个重要事件，尤其是在无症状感染高流行的群体中。个体间尿排毒强度的差异是当前研究的热点，肾功能合并症、免疫状态和疾病严重程度等因素似乎会影响病毒的持续性。关于粪便排泄，在动物和人类中均有病例报道。实验感染的美洲乌鸦和鱼鸦粪便中可定量检出高浓度WNV，峰值出现在感染后第5天，第9天则无法检出。在此类情况下，病毒可能通过胆汁排泄进入肠腔，严重免疫功能低下患者肠道和胆管中检测到WNV抗原支持了这一机制。然而，人类粪便样本阳性率低于尿液，且病毒载量通常更低，使得粪便排放在流行病学上的相关性较低。尽管临床重要性较低，但在鸟类密度较高的环境中，感染鸟类的粪便可能直接污染地表水、雨水渠和收集池，因此不应完全忽视粪便中的病毒存在。来自感染动物的粪便物质进入污水系统，可能构成废水中WNV遗传物质的来源，尽管其贡献被认为低于人类排泄，仍需进一步研究。一个关键的方法学考量是区分病毒RNA的存在（可通过RT-qPCR检测）与感染性病毒的存在（仅能通过病毒培养或动物模型证明）。许多现有研究依赖定量PCR，该方法也会检测到无感染性的病毒片段。这意味着，尽管废水中常可检测到WNV RNA，但并不一定指示存在具有复制能力的病毒颗粒。然而，从环境监测的角度来看，即使仅检测到RNA也具有诊断价值，因为它代表了人群中病毒循环的标志。病毒排泄直接影响了WNV在城市废水中的检出。考虑到约80%的感染为无症状感染，未察觉的个体经尿液排出病毒RNA的可能性，为将WBES应用于WNV提供了理论基础。类似于针对SARS-CoV-2、诺如病毒和脊髓灰质炎病毒的方法，废水监测可在临床确诊之前，为社区层面的病毒传播提供早期预警信号。

3 废水中WNV的存在

废水中WNV的检测兴趣相对较新，但随着SARS-CoV-2环境监测经验的积累，正日益受到科学界的关注。尽管尚未证实WNV的粪口传播，但已有文献证实其在动物和人类尿液中存在，这使得在城镇废水中检测到该病毒变得合理，为无创流行病学监测开辟了新视角。北美近期开展的研究证实了从WWTFs采集的环境样本中可检出WNV RNA。虽然一项研究在低发病率地区未检出WNV，但其他研究在已知有病毒循环的地区展示了废水中病毒的零星可检出性。此外，研究人员直接检测了美国五座处理厂废水固体中的WNV RNA浓度，报告中位浓度为7146拷贝/克，阳性率在3.3%至13%之间。有研究指出，虫媒病毒在废水中的病毒载量中位数可达5×10⁷基因组拷贝/人/天。进一步研究揭示了WNV在废水中的行为特征，线性分配系数（K）范围为10700至12100 mL/g，弗罗因德利希系数（K_F）介于2000至6100 mL/g之间（在加标废水样品中为24000 mL/g）。高K值意味着病毒RNA极有可能与固相结合而非存在于水相中。同时，K_F值暗示了非线性的吸附过程，验证了废水固体通过复杂的表面相互作用与病毒颗粒结合的假说。所有这些系数总体上表明，WNV选择性地与悬浮固体和污泥结合。这对WBES具有重要启示，因为初级污泥可作为检测病毒（如SARS-CoV-2）的更灵敏基质。与此同时，这也意味着固体可提供保护性环境，可能增加病毒持久性并影响后续处理的有效性。废水中WNV的检测可能源自不同的污染机制。病毒定量单位根据原始数据源分别表示为“gc”（基因组当量）、“ge”（基因组当量）或“cp”（拷贝数）。首先可归因于个体（甚至是无症状者）的尿液排泄（更罕见的是粪便排泄），因为病毒RNA可在数周内持续排出，并与固体结合，可能导致污水污泥污染及相关再利用的潜在问题。若污泥未经适当消毒即用作土壤改良剂，可能成为病毒重新引入环境的间接途径。此外，感染动物（特别是野鸟）的排泄物可通过合流制排水系统进入管道，尤其在城郊地区。在雨水和生活污水混合的合流制系统中，禽类粪便残留物、含有鸟类尸体的积水或自然环境的分泌物更易进入收集器，促成病毒的环境存在。最后，地方性流行区医院或兽医机构等局部污染源排放的治疗活动性感染患者的废水也是来源之一。为评估WNV环境监测的可行性，研究人员利用文献中的尿排泄和废水数据进行了病毒检测的理论敏感性分析。该分析显示，X（对应于一个可检测感染个体的群体规模）随分析体积的增加呈线性改善。基于临床数据（尿液排泄中位数为3×10⁴和1.1×10³ge/mL），显示出相对较高的灵敏度，仅使用50 mL处理的废水即可理论上检测到1名感染者（在280人中）或10名感染者（在10人中）。另一方面，真实废水样本中的浓度可能有所不同。模型表明，使用50 mL废水，理论上可从大约4名个体中检测到WNV RNA，且随着处理体积的增加，灵敏度进一步提高。然而，实验室加标废水样本数据显示，与临床样本相比，需要更多的废水样本量才能检出。来自某州夏季234份WWTF样本的数据，基于RT-ddPCR分析，得出在50 mL处理量下，X约为每1.3×10⁴人中有1人。这表明检测灵敏度可能因病毒载量和环境条件而有显著差异，尤其是在活跃暴发期间，同时也凸显了灵敏度随数据源（如不同人口规模和患病率）的变化。这种变异性反映了不同样本基质（尿液、废水液体和固体）以及在估算废水病毒载量时所采用假设的差异。取中位值（X=280）并假设人口规模为1000至1000000，则感染者数量约为4至3571人。因此，结果表明环境监测的有效性取决于分析的废水体积、分析灵敏度以及感染者的病毒排泄量。尽管临床数据支持个体间存在高度变异性，但环境证据表明，在有利条件下（取决于病毒载量和分析灵敏度），特别是在地方性流行或流行环境下，可在废水中检测到WNV，这与既往关于虫媒病毒的研究结果一致。需要注意的是，此分析基于代表性浓度以及对废水产生和固体产量的简化假设，并不直接反映感染性病毒的存在。为了量化废水中WNV信号的可能规模和季节性，研究人员利用流行病学监测数据和文献推导的病毒RNA排泄及WWTFs检出率估计值，重建了聚合病毒载量。具体而言，假设每名感染者的保守日病毒排泄量为6.4×10⁶基因组当量（ge），该数值处于汇总范围内。周病毒载量通过将确诊病例数乘以假设的日排泄量再乘以7天计算得出，并以ge/周表示。重建的病毒载量曲线呈现出明显的季节性模式，峰值出现在流行病学第31至34周，达到10⁹ge/周。尽管这些值不代表直接的废水测量值，但它们提供了流行期可能进入WWTFs的病毒载量的数量级近似，从而支持了基于废水的WNV监测的概念可行性。当将历史变异性（2014-2023年）转化为重建病毒载量时，产生的季节性范围跨度约为一个数量级。2024年的重建病毒载量接近这一历史范围的上限，尤其是在8月份，而2025年的数值则完全处于历史变异性范围内，这支持了重建环境信号的稳健性和内部一致性。这些结果支持了废水监测在WNV监测中的潜在作用，相较于其他方法（如直接蚊虫和人类大规模监测），后者可能低估感染、耗时且昂贵。然而，必须考虑WNV检测的潜在局限性，这需要采用高灵敏度的病毒RNA浓缩和提取方法，以及精心规划的采样策略（如频率、体积、时机）以最大化检出率。

4 环境检测与监测技术

WBES此前已被证明可用于监测具有大量无症状人群的疾病（如COVID-19），并已扩展到流感等呼吸道病毒和肠道病原体，验证了RT-qPCR或ddRT-PCR技术的适用性。RT-qPCR和ddPCR能够以高灵敏度和特异性检测WNV RNA，包括废水中的可变浓度。然而，鉴于环境基质高度复杂且富含PCR抑制剂（如蛋白质、脂肪和碳水化合物），必须进行预处理、RNA浓缩和纯化程序。废水样本通常采集自WWTFs的初级污泥或原进水，因为包膜病毒倾向于分配到废水的固相中。样本可采集为24小时混合样，初步沉淀后，若在采集后24小时内处理可冷藏于1°C至6°C，如需长期储存则冷冻于-80°C。浓缩步骤至关重要，因为WNV在人体排泄物及废水中的病毒载量可能较低。样本可与聚乙二醇（PEG）缓冲液混合并过夜储存，然后在高速下离心（如在4°C下16000×g离心45分钟）以分离上清液并获得固体沉淀。这种方法已被证明对回收虫媒病毒有效，由于其排泄率低，需要更大的处理体积以实现更高的灵敏度。带正电荷的玻璃纤维滤膜（如HA滤膜）上的吸附-洗脱技术也常用于虫媒病毒。对于比PEG沉淀法所需样本体积更小（如50 mL）的更精确分析，可使用错流过滤或切向流超滤，该技术利用特定孔径的膜截留病毒颗粒，能够截留直径大于40 nm的病毒（如WNV，直径为40-60 nm）。此外，沉降的固体在核酸提取前可进行脱水处理。下一步是病毒RNA提取，可使用商业硅胶柱试剂盒（如Qiagen RNeasy、Zymo），或使用“无试剂盒”方法，即将沉淀重悬于含异硫氰酸胍（GITC）的裂解缓冲液中并利用磁珠。GITC基缓冲液以其灭活病毒和保存RNA/DNA结构用于分子分析的有效性而闻名。为去除抑制剂，可再次使用试剂盒，并将固体重悬于特定浓度的缓冲液中。内部回收对照（如牛冠状病毒、辣椒轻型斑驳病毒或噬菌体MS2）也被用于评估RNA提取效率并检查PCR抑制剂的存在，这得益于它们在结构上的稳定性和在废水病毒学中的广泛应用。在分子水平上，WNV的RT-qPCR方案通常依赖于扩增基因组的高度保守区域。特别是NS5基因是被明确证实且广泛使用的靶标，因其高度保守性。基因的多蛋白区域（包括包膜E蛋白序列）也是常用靶标。虽然3'UTR区域是WNV基因组的公认部分和遗传决定簇，但文献强调针对5'UTR区域进行RT-qPCR检测。病毒RNA定量（如通过qRT-PCR）受众多前分析变量（如样本类型、采集时间、储存和运输条件）和分析变量（如靶核酸量、提取效率和特定qRT-PCR测定特性）的影响。研究表明，qRT-PCR获得的循环阈值（Ct）不能直接比较，因为它们仅反映使用相同方案测试的样本间的相对病毒载量差异，因此难以精确估计起始量。通常使用已知拷贝数的WNV RNA对照稀释液生成标准曲线，以评估效率、灵敏度和检测限（LOD，取决于测定方法和基质）。例如，WNV-NS5基因的95% LOD已确定约为8606 cp/反应，文献报道的检测限在15至40 cp/反应之间。然而，这些技术在灵敏度方面面临限制，例如RT-PCR的检测限可能约为200 cp/mL。复杂基质（如废水）中PCR抑制剂的存在可能导致假阴性结果。样本成分（如蛋白质含量或体积）也会影响紫外线照射等方法的有效性。为克服这些限制，研究人员提出了ddPCR，它允许对病毒RNA浓度进行绝对定量，以每克干重拷贝数（cp/g）表示。它被认为比标准PCR更能抵抗环境抑制剂，而且ddPCR提供的LOD显著更低（如液体为3.0 cp/mL，固体为2000 cp/g）。尽管ddPCR具有优势，但包括WNV在内的虫媒病毒监测很少采用这种方法，这表明实际或经济因素可能影响其广泛采用。检测到WNV RNA并不一定表明存在感染性病毒，也不应直接解释为传播风险的证据。此外，目前尚无普遍接受的WNV流行病学相关性阈值，这与其它病毒（如脊髓灰质炎病毒、SARS-CoV-2）的情况不同。当前的方法学局限性并未削弱WBES的潜力。虽然宏基因组和宏转录组学方法在临床环境中显示出检测正黄病毒属（Orthoflavivirus）的强大潜力，包括直接从脑脊液和血清等基质中检测WNV，但这些方法在废水监测中的应用仍然极为有限。为进一步改进WBES，建议将数据与当地临床发病率、阳性虫媒病例数和环境指标（如降雨量、温度）相结合。

5 废水处理与病毒去除

WNV在市政废水净化处理过程中的存活情况是评估潜在环境风险的相关因素。关于WNV在废水处理过程中行为的可用文献有限，且源自不同的实验背景。为确保清晰度，下文区分了来自废水研究的直接证据、受控实验室基质的数据以及相关替代病毒的发现。为保留WWTF的工程学特性，分析也遵循了废水处理循环路径。WWTF旨在减少市政和工业废水中的有机物和无机物负荷（如生化需氧量、氨氮、总固体）以及细菌和病毒负荷（如粪大肠菌群）。然而，它们对WNV等特定新发病原体的有效性需要针对性评估。现代WWTF的处理通常分为三个主要阶段：一级处理（机械/物理处理），旨在去除粗大的和可沉降的固体；二级处理（生物处理），涉及通过活性污泥氧化溶解性有机物；三级处理（化学或物理处理），包括消毒、澄清/絮凝和营养物（如磷）去除。关于WWTF处理对WNV和其他病毒的影响已有相关记录。WNV与其他黄病毒一样，在水生环境中被认为具有中等抗性，但对某些处理敏感。在一级处理中，沉淀的污泥倾向于通过吸附作用浓缩病毒生物标志物，包括WNV RNA。关于生物处理，先前针对包膜病毒的研究显示，在上流式厌氧污泥床（UASB）系统中病毒RNA减少了超过1.3 log，在其他阶段（如澄清池和熟化塘）也有显著去除。尽管这些结果并非专门针对WNV，但它们为包膜病毒在生物处理条件下的行为提供了指示性证据。此外，WNV对热处理敏感。暴露于56°C下45分钟可使感染性降低6 log₁₀。高温通常会加速病毒衰减。尽管后几项研究未在废水基质中进行，但它们可能与污泥处理线相关，因为在那里通常采用高温（如50°C-55°C）（例如嗜热厌氧消化）。由于WNV分配到固相中（K_F为2000-6100 mL/g），应用于污泥的热处理和生物处理可能有助于废水处理系统中的病毒减少。然而，三级处理在应对WNV等病毒方面更为有效，因为作为脂质包膜病毒，其对溶剂和表面活性剂的灭活作用敏感。关于表面活性剂和溶剂对WNV灭活的证据主要来自受控实验室条件。例如，曲拉通X-100（TX-100）已显示出6.2 log₁₀的WNV感染性降低，尽管未完全灭活。磷酸三丁酯处理显示出立即且完全的WNV灭活（即>5 log₁₀降低）。同样，0.05%的吐温-20在37°C下30分钟内降低了8 log₁₀的WNV感染性。十二烷基硫酸钠（SDS）已被证明在低至0.04%的浓度下对黄病毒有效。然而，这些结果并非源自废水系统，在推断至真实WWTF条件时应谨慎解释。例如，TX-100在0.05%-0.1%的低浓度下已被证明有效，且对相关黄病毒也有效。过氧化氢（H₂O₂）是一种强氧化剂，可通过破坏脂质膜、氧化蛋白质和损伤核酸来灭活WNV。3%的H₂O₂浓度在7小时内导致昆津病毒（WNV的一个毒株）完全灭活，并使感染性降低高达10 log₁₀，用于生产灭活疫苗。然而，臭氧的非选择性反应性需要安装专用设施进行现场生产，其应用仍局限于先进设施或高质量的三级处理。所报告的结果主要来自实验室规模实验和与疫苗相关的应用，其直接适用于全规模废水处理系统的确定性仍不确定。作为H₂O₂的替代品，氯化是全球应用最广泛的消毒方法，因其成本低、操作简单且对广谱病原体有效。暴露于游离氯（通常在0.5至2 mg/L之间）并接触20-30分钟可有效灭活大多数病原体。例如，研究显示，在低有机物基质（5%）中，施用500和1000 ppm的氯5分钟可导致WNV的滴度降低≥3.5 log₁₀，而在高有机物基质（即90%）中则降至≥2.6 log₁₀。这些结果为WNV灭活提供了直接证据，尽管基质组成强烈影响有效性。紫外线辐射作为一种有效的废水处理方法被广泛采用，因为它能损伤病毒核酸和衣壳蛋白，且不产生有害副产物（如三卤甲烷）。紫外线的效率可能因样本体积和组成而异。紫外线处理通常更适合作为澄清出水的抛光/三级消毒步骤，而非用于原废水。尽管如此，关于紫外线灭活WNV的直接证据是可用的。254 nm的UV-C光系统根据分离株的不同，使WNV感染性降低了3.59-4.40 log₁₀。另一种使用核黄素联合紫外光的方达到平均5.19 log₁₀的WNV降低因子。200 mJ/cm²的UV-C剂量已被证明可在实验室环境（如血小板浓缩物）中实现显著的WNV降低（降低>3 log₁₀）。然而，其中几项结果是在受控实验室环境（如血小板浓缩物）中获得的，与真实废水基质存在显著差异。紫外线在真实废水样本中的有效性受到基质理化特性的强烈影响。事实上，悬浮固体和有机物会降低紫外线透射率并屏蔽病毒颗粒，从而降低灭活效率。此外，次优的紫外线剂量可能导致微生物复壮现象，这凸显了需要适当的操作条件，如足够的紫外线剂量和降低浊度的预处理。超滤（UF）等方法已成功应用于从富集病毒的废水中去除虫媒病毒，特别是在分析应用中。超滤或纳滤膜可通过尺寸排阻机制将病毒与水分离。事实上，UF（即0.01-0.1 μm）可去除细菌、病毒和胶体，同时保留矿物盐。虽然UF已被证明能有效浓缩和回收废水中的虫媒病毒，但其性能取决于膜特性、回收效率和废水基质的复杂性。此外，这些工艺主要实现物理分离而非病毒灭活。在任何情况下，针对全规模废水系统中WNV的具体证据仍然有限。例如，机械过滤有助于减少黄病毒，但其有效性仍低于其他灭活方法（如紫外线或洗涤剂处理）。尽管如此，UF的大规模应用可能受到操作挑战的限制，包括膜污染、高能耗和高成本，因此更常见于高级处理或海水淡化。

6 影响WNV在环境介质中持久性的因素

WNV在环境中的持久性是理化、微生物和其他环境因素复杂相互作用的结果。理解影响WNV稳定性和存活的环境决定因素对于评估潜在环境影响具有重要意义。包膜病毒（如WNV）在暴露于最佳范围之外的温度条件时，在环境中的衰变速率往往较高。人类WNV感染往往在夏末秋初达到高峰，随后当气温降至18°C以下时迅速下降，在此温度下病毒很难在库蚊属蚊体内稳定存在。WNV的传播峰值出现在23°C至26°C之间。然而，在37°C下，虫媒病毒的90%衰变时间（T90）为天量级，这表明及时采样可能支持WBES方法的开发，同时经中温厌氧处理且水力停留时间长的污泥可能具有较低的病毒载量。对近缘黄病毒（如蜱传脑炎病毒TBEV）的研究表明，加热可快速实现完全灭活；例如，在55°C下孵育5分钟可使病毒滴度降低四个对数级以上至背景水平。这与现有的WNV和圣路易斯脑炎病毒数据一致，两者在56°C下30分钟内迅速灭活。更具体地针对WNV，在56°C下处理含WNV的血清样本45分钟可使感染性降低6 log₁₀。因此，病毒在环境中的衰变速率似乎随温度升高而加快，在较低温度下观察到更高的稳定性，在较高温度下稳定性较低。环境中的pH通常在6至8之间缓冲，但可能因工业排放、牲畜活动或极端天气事件而变化。包膜病毒（如WNV）预计在极端pH条件（酸性或碱性）下会迅速降解。然而，pH灭活的效果在黄病毒之间存在很大差异。例如，TBEV在pH 2或3、37°C下20分钟内完全灭活（近6 log降低）。相比之下，研究表明酸性溶液（即pH 4）对WNV的灭活效力非常有限。即使在pH 10下，WNV的灭活也极小（在低有机物负载基质中5分钟内降低2.0 log₁₀）。同样，寨卡病毒（ZIKV）在pH 4-12的范围内表现出高度的环境稳定性。此外，众所周知pH水平会影响病毒在固体颗粒上的吸附。例如，病毒、蛋白质和带负电荷的氨基酸与液相中的多价阳离子结合可导致生化污泥沉淀，这可能促进降解或灭活。这表明，基于这些实验，WNV在pH 4-10范围内不会显著降解。因此，WWTF中碱化或酸化系统（如用于除磷）的存在可能成为病毒控制中有用的间接灭活因素。液体样本中的总悬浮固体（TSS）含量可显著影响WNV的存活，保护其免受处理和直接暴露于消毒剂的影响。同时，这使得有机固体能够通过吸附作用天然浓缩病毒生物标志物（包括WNV RNA），从而实现对稀有核酸靶标的灵敏检测。事实上，病毒倾向于浓缩在废水的固相（即污水污泥）中，其浓度可比液相高出几个数量级，正如在初级污泥中发现的SARS-CoV-2 RNA一样。WNV的K_F范围为2000-6100 mL/g，与此前发现的SARS-CoV-2的K_F（即3200-7400 mL/g）相当。水和废水中固体的存在可保护病毒免受消毒剂灭活，特别是在样本未充分混合的情况下。在ZIKV和牛病毒性腹泻病毒灭活研究中，含90%血液的基质显示出对热量和部分消毒剂（如氯和过氧乙酸）的显著保护作用。这种物理保护作用也降低了紫外线辐射的有效性，因为不透明颗粒会屏蔽病毒；同时也降低了氯化效果，因为氯会与有机物发生反应，从而需要更高的氯剂量。例如，要灭活ZIKV，在高有机物基质中需要比低浓度基质高得多的氯浓度（即高达10000 ppm才能实现>3 log₁₀灭活，而后者仅需500 ppm即可实现>4 log₁₀灭活）。包膜病毒在暴露于阳光时可能在环境介质中降解。UV-B组分（即280-315 nm）是环境病毒的有效灭活剂。UV-B射线可通过直接和间接方式损伤核酸和蛋白质从而导致灭活。嘧啶之间以及核酸与蛋白质之间形成交联会抑制病毒转录。尽管尚无关于UV-B对WNV影响的研究，但该组分可能通过影响蚊幼虫的存活来影响WNV的传播。事实上，有研究表明UV-B辐射的存在使蚊幼虫的平均存活率从100%降至0%。然而，有机物的存在对幼虫本身的存活产生了积极影响。丝状病毒科（Filoviridae）分别在暴露于1000 μW/cm²的UV-A能量（320-400 nm）120-150分钟后完全灭活，总能量暴露量为120000和150000 μW/cm²。相比之下，西尼罗病毒在总能量暴露量为2000 μW/cm²后失活。这表明黄病毒科（Flaviviridae）所需的灭活剂量（超过100倍）远低于丝状病毒科。但也应注意，废水中的有机物和TSS（见章节5、6.3）可作为物理屏障，降低紫外线（包括太阳紫外线）的有效性。太阳辐射可通过光化学和热效应影响WNV的持久性，可能有助于环境条件下的病毒灭活。然而，其影响变化很大，并且强烈依赖于太阳强度、水深和浊度等因素，这些因素会显著限制光的穿透并降低其有效性。因此，太阳辐射可能有助于自然衰减过程，但其在控制水生环境中WNV持久性方面的作用仍取决于具体环境。其他环境因素也可能影响WNV的稳定性和检测，如盐度、酶活性和季节性因素（如水稀释）。虽然没有证据表明盐度与WNV之间存在联系，但对于其他包膜病毒（如SARS-CoV），已注意到其在尿液中的存活时间长于粪便（在20°C下达17天），这是由于尿液中存在盐分，支持渗透压。微生物活性，特别是酶促RNA降解，是环境基质中病毒持久性的关键因素。在此背景下，RNA降解主要发生在细胞外，由微生物细胞释放的RNase降解游离病毒RNA。细胞内降解机制也可能在病毒摄取或细胞裂解后发生，但其在环境基质中的作用尚不清楚。据观察，由于水解活性高，ZIKV RNA在尿液中的降解加剧。关于SARS-CoV-2，RNase释放在高压灭菌的废水中更高（在高温高压下发生细胞裂解），这些活性酶促进了RNA降解。蛋白水解酶的存在和其他微生物的浓度会影响病毒清除的速率和机制。废水中的厌氧消化过程涉及微生物活性和中间代谢物的形成（如氨、醇和挥发性脂肪酸），可通过蛋白质变性和脂质碎裂损害病毒持久性。废水中WNV RNA的检测呈现季节性模式，反映了社区中的临床病例。WNV传播高峰出现在夏末秋初，反映了蚊子丰度和病毒扩增的季节性变化。这些温暖潮湿的月份对应于通常不利于其持久性的环境条件（如高温、强烈的紫外线辐射），但也对应于更大的城市废水产生量。事实上，WBES对WNV检测的灵敏度取决于病毒排泄率和废水的稀释程度。在合流制排水系统（黑水+雨水）中，暴雨事件期间WWTFs中的WNV浓度可能被稀释5-10倍，使得检测困难。尽管如此，WBES将提供独立于个体临床检测的广泛覆盖，使其成为WNV防范的关键工具，特别是在传统监测方法往往缺失的资源有限或脆弱环境中。

7 局限性与未来展望

现有文献为合理应用WBES监测WNV奠定了基础，但某些要素仍有待深入发展。本文讨论了未来几年可能支持监测的机会。目前，尚无成熟的检测废水中WNV的国际协议。包括浓缩、提取和RT-qPCR/dPCR在内的重要步骤应标准化，以确保不同地理位置和实验室的结果具有可比性。为了以对公共卫生有用的方式解释数据，有必要定义流行病学相关阈值（如病毒拷贝数/升）。最近，WNV qPCR检测试剂盒已实现商业化，可用于废水中WNV的可靠、稳健监测，因此可能是WWTFs快速检测的良好机遇。除了常规分子方法外，通过便携式自动化生物传感器（使用适配体和微流控技术）检测废水中的WNV领域迫切需要投资开发。例如，已提出用于SARS-CoV-2和各种流感的点需病毒WBES石墨烯复用传感器。这些工具可用于排放点、WWTFs或移动监测站进行实时监测。WNV监测的技术难点（如排泄不规律、病毒载量低、与其他污染物相互干扰）可通过提高对灵敏分子诊断方法和预测模型的访问来克服，这可能有助于传染病监测的重大演变。WNV的废水流行病学不应被视为一种替代方法，而应作为传统监测方法（如监测蚊虫、鸟类和人类病例）的补充。随着耦合监测系统的发展，整合临床、虫媒和环境数据，将有可能建立更优越的预测模型，能够预测暴发并采取具体的预防措施（如局部灭虫）。