整合单细胞与批量转录组学分析鉴定结直肠癌成纤维细胞相关转录程序中候选基因DRAM1的作用

《Frontiers in Oncology》：Integrative single-cell and bulk transcriptomic analyses identify DRAM1 as a candidate gene from fibroblast-associated transcriptional programs in colorectal cancer

　　

背景：结直肠癌(colorectal cancer, CRC)具有显著的细胞异质性和肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)动态重塑特征。成纤维细胞是CRC重要的基质组分，可能通过复杂转录程序和细胞间互作促进肿瘤进展，但成纤维细胞相关的具潜在生物学意义的候选基因尚未明确。 方法：研究人员采用整合策略，结合公开单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据、拟时序(pseudotime)分析、CellChat细胞通讯分析、高维加权基因共表达网络分析(high-dimensional weighted gene co-expression network analysis, hdWGCNA)、批量转录组验证、机器学习优先级排序及实验验证。使用GSE221575数据集绘制CRC及癌旁正常组织细胞图谱并鉴定成纤维细胞相关共表达模块；候选基因在5个独立GEO批量转录组队列中进一步筛选，选取DRAM1进行qRT-PCR、Western blot、增殖、克隆形成、伤口愈合、Transwell及异种移植(xenograft)实验验证。 结果：scRNA-seq分析鉴定出CRC及癌旁组织中17个细胞簇，对应10大细胞谱系。细胞通讯分析显示基质、上皮、内皮及免疫细胞群间存在广泛信号互作，成纤维细胞在通讯网络中占据重要地位。hdWGCNA鉴定出31个成纤维细胞相关模块，提取123个候选基因。整合批量验证及机器学习分析得到5个核心基因：INHBA、COL6A3、SPARC、DRAM1和COL1A2。其中DRAM1在CRC组织及所选CRC细胞系中表达升高。功能缺失(loss-of-function)实验显示，沉默DRAM1增强CRC细胞增殖、迁移、侵袭及异种移植瘤生长，提示DRAM1表达上调可能反映一种代偿性应激反应程序而非纯粹的致癌功能。 结论：本研究对CRC成纤维细胞相关转录程序进行了整合表征，并鉴定DRAM1为源于该程序的候选基因。功能实验支持DRAM1在CRC上皮细胞模型中发挥抑瘤作用，其直接参与成纤维细胞介导的基质—免疫调控的作用尚待进一步探究。

论文解读：整合单细胞与批量转录组学分析鉴定结直肠癌成纤维细胞相关转录程序中候选基因DRAM1的作用

研究背景与意义

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是全球癌症相关死亡的主要原因之一。尽管筛查与治疗手段有所进步，复发、转移及耐药仍是临床难题。现有证据表明，上述特征不仅由肿瘤细胞内在基因改变驱动，还深受肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)中恶性细胞与基质、免疫细胞双向互作的影响。成纤维细胞是CRC微环境主要的基质成分，表现出显著表型与功能多样性，参与细胞外基质(extracellular matrix, ECM)重塑、细胞因子分泌、血管生成调节及局部免疫调控，进而影响肿瘤生长、浸润及治疗反应。然而，CRC成纤维细胞亚群的转录异质性及其与免疫等其他微环境细胞类型的通讯模式仍了解不足。为解析这一复杂性，需借助能将细胞异质性与调控程序关联的计算方法来识别成纤维细胞相关共表达模块及枢纽基因(hub gene)。本研究发表于《Frontiers in Oncology》，旨在通过整合单细胞转录组、hdWGCNA、多队列批量转录组验证及机器学习筛选，并结合体外与体内功能实验，系统表征CRC成纤维细胞相关转录程序并评估候选基因DRAM1(DNA damage regulated autophagy modulator 1)的生物学意义，为理解CRC基质—肿瘤互作提供新线索。

主要关键技术方法

研究人员使用公共GEO数据库scRNA-seq数据集GSE221575（含CRC及配对的癌旁正常组织样本）进行细胞图谱绘制、拟时序分析(Monocle2)及CellChat细胞—细胞通讯推断；对注释为成纤维细胞的群体行高维加权基因共表达网络分析(hdWGCNA)，筛选成纤维细胞特异性模块并提取候选基因；将候选基因在5个独立GEO批量转录组队列（GSE14333、GSE17536、GSE20916、GSE39582、GSE9348）中合并、批次校正(limma + sva)并行差异表达分析；采用多种机器学习算法(caret包)训练二分类模型(CRC vs 正常)，以DALEX评估特征重要性，筛选核心基因；应用CIBERSORT估算22种肿瘤浸润免疫细胞比例，ssGSEA量化Hallmark通路活性，并与核心基因行Spearman相关分析；收集临床CRC及配对癌旁标本行Western blot与qRT-PCR验证；选用HCT116、RKO细胞系行siRNA敲低，通过EdU、CCK-8、克隆形成、伤口愈合、Transwell(含Matrigel侵袭)实验评估表型；建立BALB/c裸鼠皮下异种移植模型评估体内成瘤能力。

研究结果

3.1 单细胞转录组学图谱揭示CRC细胞景观并突显成纤维细胞为主要通讯节点

经质控过滤后，t-SNE分析鉴定出17个转录迥异的细胞簇，注释为10大细胞谱系（上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞、浆细胞、肥大细胞、中性粒细胞），证实CRC微环境具高度细胞异质性。Monocle2拟时序分析示B细胞及CD4⁺T细胞多分布于早期拟时态，成纤维细胞及树突状细胞富集于晚期状态；正常与肿瘤组织间成纤维细胞、CD8⁺T细胞及CD4⁺T细胞丰度与分布差异明显。CellChat分析显示10种注释细胞谱系间存在广泛信号交换，成纤维细胞与上皮细胞、内皮细胞及多种免疫细胞亚群具有强 incoming 与 outgoing 通讯，表明成纤维细胞在CRC微环境通讯网络中处于关键节点位置。

3.2 hdWGCNA鉴定与微环境重塑相关的成纤维细胞相关共表达模块

对成纤维细胞群体行hdWGCNA（软阈值幂β=14），共识别31个共表达模块。按模块特征向量(module eigengene)连接度评估细胞类型特异性，模块15、14、7、9、20与成纤维细胞身份关联最强而被选中。从此5模块中提取123个成纤维细胞相关候选基因。GO与KEGG富集提示这些基因主要参与ECM组织、细胞增殖调控及微环境相关生物学过程，并涉及肿瘤—基质互作及免疫相关通路。

3.3 整合批量转录组分析与机器学习优先筛选出CRC成纤维细胞相关核心基因

5个GEO批量队列合并批次校正后，123个候选基因中有76个在CRC与正常组织间差异显著。将76个基因纳入机器学习二分类建模，神经网络(NeuralNet)模型判别性能最优(AUC=0.992)，特征重要性分析排名前5基因为INHBA、COL6A3、SPARC、DRAM1和COL1A2，定为成纤维细胞相关核心基因；个体ROC分析显示5者在区分CRC与正常组织中具良好判别信号。

3.4 核心成纤维细胞相关基因与CRC免疫浸润模式及通路活性相关联

CIBERSORT示CRC与正常组织间CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞及巨噬细胞等比例存在差异。5个核心基因与多种肿瘤浸润免疫细胞亚群（如T细胞、巨噬细胞）显著相关；ssGSEA示正常与CRC组织间Hallmark通路活性不同，核心基因表达与免疫相关及致癌信号通路得分存在相关性，提示其不仅反映基质特征，也与CRC微环境更广泛免疫及信号改变有关。

3.5 DRAM1在体外与体内抑制CRC细胞恶性表型

临床标本Western blot与qRT-PCR证实DRAM1蛋白及mRNA在CRC组织中高于配对癌旁正常组织；细胞系中HCT116与RKO的DRAM1表达高于正常结肠上皮细胞NCM460，故选此两株行功能缺失实验。siRNA敲低DRAM1后，EdU掺入及克隆形成实验示增殖与克隆形成能力增强，CCK-8示细胞活力上升；伤口愈合与Transwell(迁移及Matrigel侵袭)实验示迁移与侵袭能力增强；裸鼠皮下异种移植示DRAM1沉默组移植瘤体积更大、重量更重。综上，在所用CRC上皮细胞模型及异种移植模型中，DRAM1具有抑制肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭及体内成瘤的作用，其CRC组织中表达上调可能为代偿性应激反应。

讨论与结论总结

研究人员指出，CRC进展受肿瘤内在改变与TME动态重塑共同驱动，成纤维细胞作为功能异质的基质调控者日益受到重视，但其转录多样性及与免疫互作尚待阐明。本研究整合scRNA-seq、hdWGCNA、多队列验证、机器学习及功能实验，绘制了CRC微环境高分辨率细胞图谱，确认成纤维细胞为重要通讯节点；识别31个成纤维细胞相关共表达模块并从中提取123候选基因，经跨队列差异表达与机器学习筛选锁定5个核心基因(INHBA、COL6A3、SPARC、DRAM1、COL1A2)。选DRAM1深入验证，虽其在CRC组织及部分CRC细胞系中表达升高，但敲低后恶性表型增强、异种移植瘤生长加速，支持DRAM1在测试模型中发挥抑瘤作用，其上调可能代表对肿瘤相关应激（基因组不稳定、代谢应激、缺氧等）的代偿性应激—自噬/凋亡相关响应，而非经典致癌功能。本研究局限性包括：功能实验主要在CRC上皮细胞系及源于此的异种移植中进行，未直接证明DRAM1调控成纤维细胞功能或成纤维细胞介导的基质—免疫串扰；机器学习模型基于回顾性公共数据集且无前瞻性外部验证，仅作候选基因优先级排序用途；scRNA-seq发现集样本量有限，虽经多批量队列交叉验证，仍需更大scRNA-seq队列、空间转录组及成纤维细胞特异扰动实验确证。

结论(翻译)

综上所述，本研究整合分析鉴定DRAM1为源自结直肠癌成纤维细胞相关转录程序的候选基因。患者组织验证、细胞实验及异种移植实验进一步支持DRAM1在CRC上皮细胞模型中具抑瘤作用。这些发现凸显成纤维细胞相关转录程序可作为CRC候选基因发现的资源，而DRAM1直接参与成纤维细胞介导的基质—免疫调控尚需进一步机制验证。