基于失巢凋亡(anoikis)的风险模型预测肾上腺皮质癌(adrenocortical carcinoma, ACC)的预后并与免疫微环境相关联

《Frontiers in Molecular Biosciences》：An anoikis-based risk model predicts outcomes and is associated with the immune microenvironment in adrenocortical carcinoma

　　

目的：肾上腺皮质癌(ACC)是一种罕见但高度侵袭性的恶性肿瘤，治疗选择有限。失巢凋亡(anoikis)在各种癌症进展中发挥关键作用，然而其在ACC中的功能仍不清楚。方法：基于GSE19776和GSE12368数据集，研究人员识别了差异表达基因(DEG)和显著失调的失巢凋亡相关基因(ARG)。通过蛋白?蛋白相互作用(PPI)网络分析和最小绝对收缩与选择算子(LASSO)?Cox回归分析筛选核心ARG并构建风险评分模型。随后研究人员进行了功能富集分析、免疫微环境关联分析、药物敏感性分析、突变谱分析，以及在常规贴壁培养条件下靶向SKP2的体外(in vitro)实验。结果：研究人员识别出32个显著失调的ARG，并建立了一个基于6个核心基因（BIRC5、CASP9、CDK1、EZH2、MDM2和SKP2）的风险模型。高风险组患者总生存期(OS)显著更短。功能分析显示高风险ACC主要与DNA复制和细胞周期调控等生物学过程相关。高风险患者还具有较低的免疫评分和改变的肿瘤浸润免疫细胞模式，并对Gallibiscoquinazole、Cisplatin、Axitinib和Zoledronate等化疗药物敏感性增加。突变谱分析进一步确定TP53错义突变是主导分子特征。在常规贴壁培养条件下，SKP2敲低抑制了ACC细胞增殖与迁移，促进凋亡，并诱导G0/G1期细胞周期阻滞。结论：基于失巢凋亡(anoikis)的风险模型可作为ACC有用的预后工具。ARG可能参与ACC进展并与免疫微环境特征相关联，为进一步机制和转化研究提供潜在基础。

该研究论文发表于《Frontiers in Molecular Biosciences》。肾上腺皮质癌（adrenocortical carcinoma，ACC）是一种罕见但高度侵袭性的内分泌恶性肿瘤，进展迅速，治疗选择有限，预后差。大约30%–40%的患者确诊时已有转移，术后复发率高达70%，5年总生存率（overall survival，OS）低于30%。目前ACC的预后评估主要依赖临床分期和组织病理学分级，但显著的肿瘤间异质性限制了其准确性；现有分子标志物如TP53、CTNNB1的预测能力有限，亟需新型生物标志物以改善风险分层。失巢凋亡（anoikis）是由细胞脱离细胞外基质（extracellular matrix，ECM）或失去锚定依赖触发的程序性细胞死亡，在维持组织稳态和抑制转移中具有关键作用；失巢凋亡相关基因（anoikis?related gene，ARG）在其他多种癌症中的预后价值和机制已有报道，但在ACC中尚未系统研究，也不清楚ARG特征能否用于预后分层以及是否通过免疫浸润和药物敏感性影响ACC进展，这一认知缺口阻碍了靶向失巢凋亡的治疗策略开发。为此，研究人员整合基因组、免疫和临床数据，旨在系统构建并验证基于ARG的ACC预后模型，阐明其与肿瘤免疫微环境（tumor immune microenvironment，TIME）、突变谱和化疗敏感性的关联，并通过体外实验对关键基因进行功能验证。

作者开展研究用到的主要关键技术方法包括：利用GEO数据库获取GSE19776、GSE12368等微阵列数据集及GSE19750、GSE33371验证队列，并以TCGA?ACC（RNA?seq）作为训练队列；从文献收集合计434个ARG基因集；用limma包识别差异表达基因（differentially expressed gene，DEG）并与ARG取交集；通过STRING数据库构建蛋白?蛋白相互作用（protein?protein interaction，PPI）网络，在Cytoscape中用MCODE、betweenness、degree、Maximal Clique Centrality（MCC）四种算法筛选枢纽基因；在训练队列中用LASSO?Cox回归（least absolute shrinkage and selection operator?Cox）构建多基因风险评分模型，风险评分＝∑Coef_{gene i}×Exp_{gene i}，按训练队列中位数分层并在外部验证队列独立计算评分后按各自中位数分层；用Kaplan?Meier法和time?dependent ROC（receiver operating characteristic）评估预后效能；整合风险评分与临床变量构建列线图（nomogram）并绘制校准曲线；用DAVID平台做基因 ontology（Gene Ontology，GO）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集，用基因集变异分析（gene set variation analysis，GSVA）评估DNA复制相关通路；用ESTIMATE算法计算基质评分、免疫评分和ESTIMATE评分，用CIBERSORT基于LM22矩阵估算22种肿瘤浸润免疫细胞（tumor?infiltrating immune cell，TIIC）比例；用maftools做突变景观分析，用oncoPredict预测化疗药物敏感性；样本来源于上述公共转录组和突变数据集以及人ACC细胞系NCI?H295R、SW?13。

3 Results（结果）

3.1 DEGs and hub genes in ACC（ACC中的差异表达基因与枢纽基因）：研究人员合并GSE19776和GSE12368筛选出743个DEG，其中32个为显著失调ARG；通过PPI网络及四种拓扑算法交集得到10个枢纽ARG（EZH2、CDC25C、MDM2、SKP2、BIRC5、CDK1、BCL2L1、EGF、CDH2、CASP9），为后续建模提供候选基因集。

3.2 Construction and validation of the prognostic model（预后模型的构建与验证）：在TCGA?ACC训练队列中LASSO?Cox回归最终选出6个预后ARG（BIRC5、CASP9、CDK1、EZH2、MDM2、SKP2）构建风险评分公式；按训练队列中位数分层后，高风险组OS显著更短（P＜0.001），训练队列3、5、7年AUC分别达0.943、0.934、0.888；在外部验证队列GSE19750＋GSE33371合并验证中，按各验证队列自身中位数分层，高风险组OS仍显著更短（P＝0.018），3、5、7年AUC为0.777、0.767、0.697；单因素和多因素Cox证明风险评分是独立预后因素。

3.3 Association of the risk score with clinicopathological features（风险评分与临床病理特征的关联）：在训练队列中IV期肿瘤风险评分显著高于III、II、I期（P＜0.05）；在验证队列中男性风险评分显著高于女性（P＜0.05），年龄≥60岁者显著高于＜60岁者（P＜0.05）；风险评分与各核心ARG表达量呈对应方向分布。

3.4 Close association of the risk score with DNA replication and cell cycle（风险评分与DNA复制和细胞周期的密切关联）：GO和KEGG富集显示高风险评分显著关联细胞周期相关生物学过程（DNA复制、细胞器分裂、核分裂）、染色体结构组分、DNA相互作用分子功能以及DNA复制、细胞周期调控、错配修复通路；GSVA证实风险评分与DNA复制相关基因集富集分数呈显著正相关，且随风险评分升高呈阶梯式增强。

3.5 The individualized prediction model showed favorable calibration performance（个体化预测模型显示出良好校准性能）：研究人员整合风险评分、肿瘤分期、性别、年龄构建列线图以预测1、3、5年OS概率；校准曲线显示训练队列和验证队列中预测与观察生存概率一致性可接受，提示该列线图可作为潜在综合预后工具但需在更大前瞻性队列中评估。

3.6 Differences in immune infiltration between risk groups（风险组间免疫浸润差异）：ESTIMATE分析表明训练与验证队列中高风险组基质评分、免疫评分、ESTIMATE评分均显著低于低风险组，低免疫评分关联更差生存率；CIBERSORT显示训练队列高风险组CD8⁺T细胞、M1与M2巨噬细胞浸润显著减少，静息NK细胞与M0巨噬细胞增加；验证队列高风险组M2巨噬细胞减少，M0巨噬细胞和静息树突状细胞增加；6个ARG与特定TIIC子集存在亚组特异性相关；整体提示风险模型与免疫微环境特征相关联，但免疫浸润模式在数据集间未完全一致。

3.7 Molecular features of TP53 missense mutation and drug sensitivity analysis in high?risk ACC（高危ACC中TP53错义突变的分子特征及药物敏感性分析）：突变景观分析（TCGA?ACC）显示高危组与低危组突变谱异质，错义突变为主，TP53突变频率最高（26%），且高危组TP53突变发生率显著高于低危组；CTNNB1、MUC16突变频率均为24%；药物敏感性预测表明高危组对Gallibiscoquinazole、Cisplatin、Axitinib、Zoledronate的敏感性评分更低（提示更高治疗响应倾向），在训练和验证队列中趋势一致。

3.8 Knockdown of SKP2 inhibits the malignant progression of ACC cells（SKP2敲低抑制ACC细胞恶性进展）：鉴于SKP2在ACC中功能尚不清，研究人员在常规贴壁培养下用siRNA敲低SKP2，经RT?qPCR和Western blotting确认效率；CCK?8显示SKP2敲低显著降低NCI?H295R和SW?13增殖能力；伤口愈合实验表明SW?13迁移能力减弱；Annexin V?FITC/PI流式细胞术显示凋亡比例显著增加；PI染色细胞周期分析显示G₀/G₁期比例升高、S期比例降低；综上SKP2敲低关联ACC细胞增殖与迁移抑制、凋亡促进及G₀/G₁期阻滞，但实验未在专用失巢凋亡诱导条件下进行，不能直接证明SKP2调控失巢凋亡抗性。

4 Discussion（讨论）：ACC因侵袭性强、治疗有限、可靠预后标志物缺乏仍是挑战；本研究整合多组学数据构建基于ARG的预后模型，识别32个失调ARG及6基因签名（BIRC5、CASP9、CDK1、EZH2、MDM2、SKP2），其中BIRC5抗凋亡、EZH2转录重编程、MDM2负系数受多元共线和TP53?MDM2互作影响而非保护性作用；模型在训练队列AUC优秀但验证队列略有下降，提示潜在过拟合可能，需更大独立队列验证；高风险关联DNA复制与细胞周期异常激活、TP53错义突变主导，与基因组不稳定一致；CTNNB1、MUC16共突变提示Wnt信号和免疫逃逸参与；ESTIMATE和CIBERSORT显示高风险低免疫/基质评分及特定TIIC改变（巨噬细胞趋势较一致），但跨队列不完全一致，且基于回顾性转录组反卷积而非免疫治疗后队列，不能直接预测免疫治疗响应；药物敏感性预测提示高危对数种药物更高敏感性，但需实验与临床验证；SKP2敲低体外印证其促恶性表型，但仅SKP2做了功能实验，其余模型基因需进一步研究，且实验非失巢凋亡专用条件；研究局限包括ACC样本量小、队列特异中位数截断影响可比性、CIBERSORT未按P值过滤、体外非常规失巢凋亡条件、仅用最优siRNA不排除脱靶、无体内实验；未来需多中心大队列、更多功能实验、挽救实验和动物模型。

5 Conclusion（结论）：基于失巢凋亡（anoikis）相关基因特征可作为ACC潜在的实用预后工具，并与DNA复制相关通路、免疫微环境特征和药物敏感性模式相关联；列线图可为风险评估提供潜在综合方法，但临床效用需进一步验证；SKP2可作为后续研究的候选基因，但需更多机制研究、独立队列验证和体内实验才能得出明确转化结论。